丹翹液對脂多糖誘導RAW264.7細胞炎癥相關因子的抑制效應分析

魏立琴，王東升，董書偉，鄺曉嬌，張世棟*，嚴作廷*

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/農業部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州 730050；2.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070)

丹翹液對脂多糖誘導RAW264.7細胞炎癥相關因子的抑制效應分析

魏立琴1，2，王東升1，董書偉1，鄺曉嬌1，張世棟1*，嚴作廷1*

(1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所/農業部獸用藥物創制重點實驗室/甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州 730050；2.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070)

為研究丹翹液的體外抗炎作用及其抗炎機制，利用LPS誘導巨噬細胞建立炎癥模型，MTT法檢測不同濃度丹翹液對RAW264.7細胞活力影響；NO測試盒檢測丹翹液對LPS誘導的NO釋放量的影響；ELISA方法檢測丹翹液對LPS誘導的TNF-α、IL-6和PGE2分泌的影響；RT-PCR方法檢測丹翹液對LPS誘導的TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因轉錄的影響；Western blot檢測對細胞核內NF-κB p65蛋白表達的影響。結果顯示丹翹液小于700 μg·mL-1對細胞無毒性作用；丹翹液各劑量組(100、300、600 μg·mL-1)能不同程度地抑制LPS誘導的NO、PGE2、TNF-α和IL-6的分泌；能顯著抑制iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6基因轉錄和細胞核內 NF-κB p65蛋白表達。丹翹液的抗炎作用機制可能與抑制NF-κB 通路激活，進而抑制炎癥介質和炎性細胞因子的轉錄和表達有關。

丹翹液；抗炎機制； RAW264.7；LPS；炎癥模型

炎癥是機體對各種致炎因素及損傷所產生的具有防御意義的應答性反應，其在一定時期內對機體是有利的，可以提高機體抵抗力，但劇烈或持久的炎癥反應會對機體造成損失，影響動物機體的健康，炎癥反應是一些疾病的發病基礎[1-2]。近年來，中藥制劑對炎癥有較好的抑制效果，由于其毒副作用小，對機體不良反應較少，其影響炎癥免疫反應作用的機制受到了廣泛的關注[3-4]。中藥影響炎癥免疫反應的機制包括影響炎性介質和炎性細胞因子的作用、核因子的功能、活性氧的生成、神經內分泌激素的生成等[4-6]。

丹翹液是以丹參和連翹等中草藥為主要成分，依據活血化瘀、縮宮排膿的治療原則研制而成的中藥子宮灌注劑，臨床上主要用于防治奶牛子宮內膜炎[7-8]。動物藥理學研究顯示，丹翹液具有良好的抗炎、鎮痛的藥理效應[9]，但是丹翹液的抗炎作用機制尚不清楚。因此，本試驗利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導巨噬細胞RAW264.7，建立炎癥模型，并研究了丹翹液對炎癥細胞模型的影響，旨在探討丹翹液的體外抗炎作用及其抗炎機制，為該新藥的研發提供理論基礎和實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 小鼠單核/巨噬細胞株 RAW264.7(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)添加含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的 DMEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內常規培養。取對數生長期的細胞用于試驗。

1.1.2 試劑和儀器 脂多糖(E.coli0111：B4)、噻唑藍(MTT)購自Sigma 上海公司；胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶購自美國 GIBCO 公司；小鼠 TNF-α、IL-6、PGE2的 ELISA 檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol購自美國 Invitrogen 公司；RT-PCR 試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒購自日本TaKaRa公司；引物由北京六合華大基因合成；HRP羊抗兔IgG購自西安壯志；兔多克隆抗體NF-κB p65購自Abcam； DMI6000B倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)；SpectraMaxM2/M2e 多功能酶標儀(美國Molecular Devices 公司)；CFX96 型定量 PCR 儀(美國Bio Rad公司)； HeaL Force HF90型CO2培養箱(中國上海力康有限公司)。

1.1.3 中藥丹翹液的制備 稱取丹參1 200 g、連翹800 g，粉碎成粗粉，加乙醇加熱回流提取3次，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，干燥，加入800 mL聚乙二醇-200，4 000 r·min-1離心20 min，上清液合并后再加入聚乙二醇-200定容至1 000 mL，滅菌，即得每1 mL相當于原生藥2 g的藥液，4 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞實驗分組及處理 取對數生長期RAW264.7細胞接種于培養板，細胞密度為8 ×104·mL-1，預培養24 h后進行分組處理。① 正常對照組：不做任何處理，正常培養 24 h；② 炎癥模型組(LPS)：1 μg·mL-1LPS 持續刺激細胞 6 h；③丹翹組：600 μg·mL-1丹翹液作用細胞 24 h；④試驗組：1 μg·mL-1LPS 持續刺激RAW264.7細胞6 h后，加入不同濃度的丹翹液(100、300、600 μg·mL-1)共同作用24 h。

1.2.2 細胞毒性試驗 細胞毒性評價采用MTT試驗，取對數生長期RAW264.7細胞接種于96 孔板中，細胞分組及處理方法同1.2.1，培養結束后，每孔加入20 μL的MTT(5 mg·mL-1)繼續培養4 h，棄去培養液，每孔加入100 μL的DMSO溶解甲瓚，均勻振蕩溶解完全后在 570 nm 處檢測各孔的吸光度。試驗重復3次以上。1.2.3 NO含量測定 取對數生長期RAW264.7細胞接種于24 孔板中，細胞分組及處理方法同1.2.1，培養結束后，收集各組細胞上清液，按照NO試劑盒說明書檢測細胞上清中NO的釋放。酶標儀測定550 nm處的光吸收值，以亞硝酸鈉作為對照品測定并計算NO的濃度。

1.2.4 ELISA檢測TNF-α、IL-6、PGE2含量 取對數生長期RAW264.7細胞接種于24 孔板中，細胞分組及處理方法同1.2.1，培養結束后，收集各組細胞培養上清液，ELISA法檢測各組TNF-α、IL-6、PGE2含量，操作步驟按照試劑盒說明書。

1.2.5 RT-PCR法檢測TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因轉錄水平 取對數生長期RAW264.7細胞接種于6 孔板中，細胞分組及處理方法同1.2.1，培養結束后，Trizol法提取各組細胞總RNA，按試劑盒說明書操作，將mRNA逆轉錄為cDNA，得到的cDNA用于RT-PCR檢測TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS基因的相對轉錄水平。PCR引物見表1。RT-PCR反應條件是95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，循環40次；55～95 ℃循環81次，mRNA的相對轉錄量采用2-△△Ct方法計算，并以β-actin為內參基因。

表1 RT-PCR引物序列

Table 1 RT-PCR oligo-nucleotide primers

引物primers序列GenesequencePCR產物/bpPCRproduct退火溫度/℃Annealingtemperatureβ?actinForwardReverse5′?GCCACCAGTTCGCCATGGAT?3′5′?GCTTTGCACATGCCGGAGC?3′7058TNF?αForwardReverse5′?TCGAGTGACAAGCCCGTAG?3′5′?CAGCCTTGTCCCTTGAAGAG?3′18058IL?6ForwardReverse5′?CTGATGCTGGTGACAACCAC?3′5′?TCCACGATTTCCCAGAGAAC?3′14359iNOSForwardReverse5′?GGACCCAGTGCCCTGCTTT?3′5′?CACCAAGCTCATGCGGCCT?3′17865COX?2ForwardReverse5′?TGAGTACCGCAAACGCTTCTC?3′5′?TGGACGAGGTTTTTCCACCAG?3′15165

1.2.6 Western blot 檢測 NF-κB 蛋白表達 取對數生長期RAW264.7細胞接種于6孔板中，細胞分組及處理方法同1.2.1，培養結束后，根據試劑盒說明提取總蛋白質、細胞核蛋白，BCA 法測定各組蛋白質濃度，各組取40 μg蛋白質樣品與蛋白質上樣緩沖液混勻，沸水中變性 10 min后，在10% 分離膠、5% 濃縮膠中100 V恒壓進行SDS-PAGE電泳2.5 h，結束后半干轉移法12 V恒壓轉印1 h到PVDF膜上，用 5%的BSA封閉 1 h，加入一抗過夜孵育(4 ℃)，TBST 洗膜4次，每次10 min，加入HRP 標記的二抗在室溫緩慢搖動孵育 2 h，TBST 洗滌10 min×4次，加ECL，暗室膠片曝光、顯影、定影后顯示各組細胞中目標蛋白質表達水平。

2 結 果

2.1 丹翹液對RAW264.7細胞活力的影響

圖1A為MTT法檢測細胞經不同劑量的丹翹液處理后的細胞活力變化。結果顯示，與空白對照組相比，丹翹液≤700μg·mL-1時對細胞無毒性作用(P>0.05)，當丹翹液大于700μg·mL-1時，細胞活力明顯下降(P<0.01)。圖1B為丹翹液和LPS共同處理后細胞的活力變化，結果與丹翹液單獨處理的一致。

2.2 丹翹液對LPS誘導的細胞炎癥介質的影響

NO檢測結果顯示，與正常對照組相比，LPS處理組的NO釋放量極顯著升高(P<0.01)，丹翹液處理組的NO釋放量不明顯，與LPS處理組相比，丹翹液各組均能極顯著抑制NO的釋放量(P<0.01)。各劑量丹翹液抑制后NO含量與正常對照組差異顯著(P<0.01或P<0.05)(圖2A)。ELISA檢測PGE2結果顯示，與正常對照組相比，LPS處理組的PGE2釋放量極顯著升高(P<0.01)，與LPS處理組相比，丹翹液高、中劑量組能顯著抑制PGE2的釋放量(P<0.05或P<0.01)，低劑量差異不顯著(P>0.05)。高劑量丹翹液抑制后PGE2含量與正常對照組無顯著差異(P>0.05)，中、低劑量丹翹液抑制后PGE2含量與正常對照組顯著差異(P<0.01或P<0.05)(圖2B)。

A.不同濃度的丹翹液(0～1 000 μg·mL-1)作用24 h時細胞的活力變化；B.1 μg·mL-1LPS 持續刺激RAW264.7細胞6 h后，不同濃度的丹翹液(0～1 000 μg·mL-1)作用24 h時細胞的活力變化。標注不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)，標相同或未標字母表示組間差異不顯著(P>0.05)A.Viabilities of cells that treated with or without Danqiao liquid(0-1 000 μg·mL-1) for 24 h；B.Cells were treated with or without Danqiao liquid for 24 h after exposure to LPS(1 μg·mL-1) for 6 h.Values with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01)，and with the same letters or without letters mean not significant difference(P>0.05)圖1 丹翹液對RAW264.7細胞的毒活性作用Fig.1 The effects of Danqiao liquid on viability in RAW264.7 cells

標注不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)，標注不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，標相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。下圖同Values with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01)，with different letters mean significant difference(P<0.05)，and with the same letters mean not significant difference(P>0.05).The same as below圖2 丹翹液對LPS誘導RAW264.7細胞分泌NO和PGE2的影響Fig.2 The effects of Danqiao liquid on PGE2 and Nitrite in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

2.3 丹翹液對LPS誘導的炎癥細胞因子分泌的影響

圖3A、B為 ELISA法檢測丹翹液對 LPS誘導的RAW264.7 細胞上清液中TNF-α和IL-6含量的影響，結果顯示，與正常對照組相比，LPS處理組的TNF-α、IL-6釋放量極顯著升高(P<0.01)，丹翹液組的釋放量變化不明顯(P>0.05)，與LPS處理組相比，高劑量丹翹液能顯著抑制 TNF-α、IL-6的釋放量(P<0.01或P<0.05)，但中、低劑量對TNF-α、IL-6的抑制無統計學意義(P>0.05)。高劑量丹翹液抑制后TNF-α、IL-6含量與正常對照組無顯著差異(P>0.05)，低劑量丹翹液抑制后TNF-α、IL-6含量與正常對照組極顯著差異(P<0.01)。

圖3 丹翹液對LPS誘導RAW264.7細胞的炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的影響Fig.3 The effects of Danqiao liquid on TNF-α and IL-6 in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

2.4 丹翹液對LPS誘導的炎癥相關基因轉錄的影響

RT-PCR檢測各處理組細胞的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2基因的相對轉錄水平，結果顯示，與正常組相比，LPS處理組的TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2 mRNA轉錄均極顯著升高(P<0.01)，與LPS處理組相比，丹翹液各劑量組均能夠顯著抑制LPS誘導巨噬細胞iNOS和COX-2 mRNA 轉錄的升高(P<0.01或P<0.05)(圖4A、B)，也能夠顯著抑制TNF-α、IL-6 mRNA 轉錄的升高(圖4C、D)，且對TNF-α、iNOS和COX-2具有一定的劑量效應。各劑量丹翹液抑制后IL-6、iNOS和COX-2 mRNA轉錄與正常對照組相比差異極顯著(P<0.01)，高、中劑量丹翹液抑制后TNF-α mRNA轉錄與正常對照組相比，無顯著差異(P>0.05)。

圖4 丹翹液對LPS誘導RAW264.7細胞的炎癥相關基因轉錄的影響Fig.4 The effects of Danqiao liquid on gene transcription of TNF-α，IL-6， iNOS and COX-2 in RAW264.7 macrophage cells induced by LPS

2.5 核轉錄因子NF-κB 蛋白表達

Western blot對不同處理組細胞內NF-κB p65 蛋白表達檢測，結果顯示：與正常對照組相比，LPS 刺激 RAW264.7 細胞活化后，細胞核內 NF-κB p65蛋白表達極顯著升高(P<0.01)，與LPS處理組相比，不同濃度的丹翹液處理后，顯著抑制NF-κB p65 表達(P<0.05)，并呈現劑量依賴性(圖5)。

圖5 丹翹液對LPS 誘導RAW264.7細胞的NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.5 The effects of Danqiao liquid on nuclear translocation of NF-κB p65 in RAW264.7 cells by LPS

3 討 論

炎癥是機體對于刺激的一種防御反應，表現為紅腫熱痛和功能障礙。炎癥反應是損傷與抗損傷的過程，損傷因子一方面可以直接或間接破壞組織和細胞，另一方面可以通過炎癥充血和滲出反應，殺傷和包圍損傷因子，通過實質和間質細胞的再生修復和愈合受損的組織[10-11]。如損傷過程占優勢，則炎癥加重，并向全身擴散；若抗損傷過程占優勢，則炎癥逐漸趨向痊愈。所以，控制損傷、加強抗損傷過程是機體維持正常生理功能的重要環節。巨噬細胞參與吞噬、免疫調節、組織修復、新陳代謝和炎癥等多種生理過程。微生物刺激巨噬細胞產生多種促炎性細胞因子和趨化因子，這些促炎因子反過來引起細胞滲出和激活其他類型的免疫細胞(如T細胞)，這些因素共同介導形成免疫炎癥反應[12-13]。因此本研究利用LPS誘導巨噬細胞炎癥反應模型對丹翹液的體外抗炎作用及機制進行深入的探討。本試驗首先檢測丹翹液對RAW264.7細胞活力的影響，MTT試驗結果表明，藥物濃度在700 μg·mL-1以內對RAW264.7細胞無明顯毒性作用。因此，選擇0～700 μg·mL-1的丹翹液進行下一步的抗炎活性研究。

NO既能參與機體生理過程的調節及免疫應答反應，其過度產生又可導致組織損傷和炎性反應。體內NO產生由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)產生。NOS可以分為結構型(eNOS)和誘導型(iNOS)。eNOS只產生少量NO，發揮正常生理作用，病原微生物感染及組織損傷都可誘導iNOS表達，促進NO大量產生。NO具有抗炎和促炎雙重功能[14-15]。少量NO可通過抑制中性粒細胞與內皮細胞的黏附表現抗炎活性[16]。反之，炎癥性疾病過程中，過度的NO通過激活NF-κB誘導促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6等的產生促進炎性反應，這些細胞因子又能激活iNOS，促進機體產生更多的NO，使NO及細胞因子的分泌得以持續，從而使炎癥反應更持久，更劇烈[17]。環氧酶(COX)是機體催化花生四稀酸轉變為前列腺素的限速酶，COX有三種同工酶，其中COX-2為誘導性表達，在脂多糖(LPS)等炎癥因子的誘導下，COX-2大量合成，進而催化PGs大量合成，參與并放大炎癥反應[18-21]。在炎癥過程中，若能夠抑制炎性介質NO和PGE2的釋放及其催化酶的活化，就能有效抑制其介導的炎癥反應。本研究結果顯示，LPS刺激細胞后NO 和PGE2的分泌水平極顯著升高，說明細胞發生了極顯著的炎癥反應，不同劑量的丹翹液作用炎性細胞后均能顯著抑制LPS誘導的NO和PGE2的分泌及iNOS和COX-2 mRNA的轉錄，且表現出一定的劑量效應，結果表明丹翹液抑制炎癥限速酶的基因表達和介質分泌是其抗炎機制之一。但是丹翹液抑制后NO和PGE2的分泌及iNOS和COX-2 mRNA轉錄與正常對照組相比有顯著差異，說明丹翹液有抗炎癥作用，但不能完全阻斷細胞的炎癥反應。

細胞因子是一類具有廣泛生物學活性、且功能復雜的小分子蛋白質。TNF-α主要由單核巨噬細胞產生，被視為促進炎癥反應最重要的細胞因子之一，它能引起急性炎癥性疾病并引起組織損傷[22-23]。IL-6也是誘導炎癥反應的主要因素，它能促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的分化，和其他炎性細胞因子協同作用，級聯促進和放大炎癥反應造成組織損傷[24]。因此，TNF-α和IL-6作為炎癥標志物，對藥物的抗炎作用研究具有指示作用[25]。試驗結果顯示，高劑量丹翹液能顯著抑制細胞炎癥反應中TNF-α和IL-6的釋放，但中、低劑量對TNF-α和IL-6的釋放抑制效果不顯著。同時TNF-α和IL-6基因的相對轉錄結果顯示，丹翹液各劑量組均能劑量依懶性的抑制TNF-α和IL-6的轉錄，以上結果說明丹翹液對促炎細胞因子分泌的抑制是抑制其基因轉錄的結果。此外，兩種檢測結果間有差異可能與不同方法的靈敏度有關。

此外，NF-κB是重要的核轉錄因子，在炎癥反應的各階段起重要的調控作用，其主要的誘導型亞基是p50/p65[26]。 靜息狀態時，NF-κB與 IκB 形成復合體存在于細胞質中。當受到特定刺激后，IκB 被活化的激酶復合體(IκB kinase，IKK)磷酸化，NF-κB與 IκB 解離，游離的 NF-κB p65迅速轉移到細胞核，與κB 結合位點結合，啟動炎性介質及促炎癥細胞因子的轉錄與表達[27-31]。本試驗NF-κB蛋白表達結果顯示，LPS刺激細胞后，細胞核內NF-κB p65蛋白表達升高，說明NF-κB被激活并轉移至細胞核內，丹翹液能抑制細胞核內NF-κB p65蛋白表達升高，說明丹翹液可抑制NF-κB的活化與核轉移，進而抑制炎癥相關基因的表達與炎癥介質的產生。

4 結 論

丹翹液能夠抑制LPS刺激巨噬細胞產生炎性介質NO和PGE2；也能抑制炎性因子TNF-α和IL-6的分泌及其基因轉錄；亦對炎癥關鍵酶iNOS、COX-2的基因轉錄具有抑制作用。丹翹液能抑制LPS對巨噬細胞內NF-κB信號通路的激活，抑制NF-κB p65活化因子的入核轉移，從而抑制炎癥過程中關鍵酶和炎癥因子的基因表達及炎癥介質的產生。因此，丹翹液對LPS誘導巨噬細胞炎癥反應具有抗炎保護作用。

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(編輯 白永平)

Inhibiting Effect Analysis ofDanqiaoLiquid on Inflammation-related Factors Induced by LPS in RAW264.7 Cells

WEI Li-qin1，2，WANG Dong-sheng1，DONG Shu-wei1，KUANG Xiao-jiao1，ZHANG Shi-dong1*，YAN Zuo-ting1*

(1.LanzhouInstituteofHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS/KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticsDiscovery，MinistryofAgriculture/Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince，Lanzhou730050，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

The aim of the present study was to study the anti-inflammatory effects and possible underlying mechanisms ofDanqiaoliquid in LPS-stimulated RAW264.7 cells.The cytotoxicity ofDanqiaoliquid was detected by MTT method.The NO kit assay was adopted to detect the effect ofDanqiaoliquid on NO release from LPS-induced RAW264.7 cells.ELISA was used to evaluate the production of TNF-α，IL-6 and PGE2in LPS-induced RAW264.7 cells.Real-time PCR was used to detect the transcription of COX-2，iNOS，TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells.The protein expression of nuclear NF-κB p65 was detected by Western blot.The result showed that the safe medication range ofDanqiaoliquid was less than 700 μg·mL-1.Compared with the LPS model group，Danqiaoliquid(100，300，600 μg·mL-1) could reduce the secretion of NO，PGE2，TNF-α，and IL-6 in cells induced by LPS，and significantly inhibit the mRNA transcription of iNOS，COX-2，TNF-α，IL-6 and the protein expression of NF-κB p65.In conclusion，this study preliminarily proves the protective effect ofDanqiaoliquid on LPS-induced RAW264.7 macrophages.Its action mechanism may be related to inhibit NF-κB signal pathway and the genes expressions and secretion of inflammatory mediators and cytokines.

Danqiaoliquid；anti-inflammatory mechanism；RAW264.7；LPS；inflammatory models

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.023

2015-04-13

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD12B03)；中國農業科學院科技創新工程-奶牛疾病研究

魏立琴(1986-)，女，甘肅蘭州人，碩士，主要從事中獸醫臨床和奶牛疾病防治的研究，E-mail：24weiliqin@163.com，Tel：0931-2115262

*通信作者：張世棟(1983-)，男，甘肅張掖人，助理研究員，碩士，主要從事藥理毒理學研究，E-mail：zhangshidong@caas.cn，Tel：0931-2115262；嚴作廷(1962-)，男，甘肅武威人，研究員，博士，主要從事中獸醫臨床和奶牛疾病防治的研究，E-mail：yanzuoting@caas.cn，Tel：0931-2115261

S853.9

A

0366-6964(2015)12-2299-08