副豬嗜血桿菌鐵調節外膜蛋白的免疫原性研究

韓端丹， 周明光

(1.武漢東湖學院， 武漢 430077； 2.武漢科前動物生物制品有限責任公司， 武漢 430070)

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韓端丹1*， 周明光2

(1.武漢東湖學院， 武漢 430077； 2.武漢科前動物生物制品有限責任公司， 武漢 430070)

副豬嗜血桿菌感染已對世界養豬業造成巨大損失，作為一新發的細菌傳染病，目前對其致病及免疫機理研究較少，故應用蛋白質組學及反向疫苗學技術有助于開發其新型疫苗.通過研究，鑒定出副豬嗜血桿菌的3種鐵調節外膜蛋白IROMP1， IROMP B和HbpB.選擇這3種蛋白進行免疫原性和攻毒保護試驗研究，結果表明其中的HbpB能誘導明顯的混合抗體(IgG1和IgG2a)應答，其高免血清具有明顯的調理吞噬活性，HbpB能在小鼠攻毒試驗中提供90%保護率，因此HbpB可成為開發副豬嗜血桿菌亞單位疫苗的候選免疫原性蛋白.

副豬嗜血桿菌； 鐵調節外膜蛋白； 反向疫苗學； 免疫原性

副豬嗜血桿菌引起豬多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎[1-2]，死亡率高，給全球養豬業帶來巨大損失[3-5].作為一種新發的細菌傳染病，因對其研究起步晚，故對其毒力因子與致病、免疫機制知之甚少，從而使該病的防控受到制約[6].革蘭氏陰性菌的外膜蛋白(OMP)是發展疫苗的重要靶標，而運用免疫蛋白質組學方法可快速鑒定OMP[7-9].細菌常通過膜上特殊的蛋白受體轉運鐵載體復合物以便從宿主體內攝取鐵，此類外膜受體稱為鐵調節外膜蛋白(IROMP).革蘭氏陰性菌中IROMP抗體可阻斷鐵離子攝取系統，并能誘導保護性免疫應答，因此成為開發細菌疫苗的主要目標免疫蛋白之一.本實驗應用反向疫苗學技術，通過生物信息學分析、抗原表位預測等選擇有關蛋白進行體外表達，成功獲得3種鐵調節外膜蛋白，即IROMP1、IROMP B和HbpB，并以此進行后續的免疫原性研究和小鼠攻毒保護試驗.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株、疫苗、質粒及實驗動物：HPS 5型臨床分離株，于2001年4月河北石家莊市發病豬場分離得到；HPS 5型全菌滅活疫苗購自武漢科前股份有限公司；4 w齡BALB/c小鼠購自湖北省實驗動物研究中心；克隆菌株E.coliDH5α、表達菌株E.coliBL-21、巨噬細胞、表達載體pET-28a(+)均為實驗室保存.

主要試劑：辣根過氧物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a購自SouthSernBiotech公司；十二烷基肌氨酸鈉(SKL)、FITC熒光二抗、Marcol 52佐劑、PCR試劑等試劑均購自國內各生物試劑公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 表達重組外膜蛋白 將鑒定正確的重組質粒的單菌落在LB培養基中培養，加入IPTG誘導5 h后洗滌，重懸菌體并用超聲波破碎，離心收集上清和包涵體.SDS-PAGE檢驗重組蛋白表達在上清中還是包涵體中.包涵體用PBS洗滌3次后加Buffer A及SKL，劇烈攪動，4℃過夜使其緩慢溶解，離心收集上清，并加入PEG4000、氧化型谷胱甘肽(終濃度為1 mM)及還原型谷胱甘肽(終濃度為2 mM)，靜置4℃復性，每6 h換透析液.最后用TE透析，定量后保存備用.

1.2.2 ELISA檢測ELISA法檢測重組蛋白誘導的體液免疫應答情況.免疫前采集的血清作陰性對照.用250 ng/100 μL的重組蛋白包被酶標板4℃過夜，1%BSA閉1 h，洗滌后保存.待檢血清1∶40稀釋后取100 μL加入酶標板中，37℃孵育45 min，洗滌后加入1∶5000 倍稀釋的羊抗豬IgG(H+L)-HRP二抗，37℃孵育45 min.洗滌后加入底物液，避光顯色15 min后加終止液，OD630nm處讀數.

1.2.3 HPS陽性對照血清的制備 16±2 g昆明雌鼠購自湖北省醫學科學院，共10只.每只老鼠按1.0 × 109CFU的劑量肌肉注射HPS全菌滅活疫苗，2 w后用相同的疫苗加強免疫，4 w后收集血清作為陽性對照血清.

1.2.4 調理吞噬試驗 5只小鼠腹腔注入1 mL弗氏完全佐劑并加強免疫1次，1 w后安樂死，收集腹腔巨噬細胞并調整細胞數至1.0 × 106/100 μL再稀釋到100 μLPBS中(約含1.0×104個細菌).殺菌樣品配比如下：試驗組：巨噬細胞+HPS+滅活的免疫血清+免疫前血清(補體)；對照組：巨噬細胞+HPS+滅活的對照血清+免疫前血清(補體).混合后37℃培育1 h，10倍稀釋后36 h內細菌計數.

1.2.5 攻毒試驗 4 w齡BALB/c小鼠隨機分為6組，每組10只小鼠.分別將50 μg的重組蛋白IROMP1， IROMP B或HbpB與1.5倍體積的Marcol 52佐劑乳化制成疫苗腹腔注射免疫小鼠.2 w后再加強免疫1次，PBS加佐劑為對照組，單獨PBS為空白組.二免7 d后采血，取血清測效價.免疫前的血清作陰性對照.加強免疫2 w后對小鼠進行攻毒試驗.每種蛋白免疫的小鼠腹腔接種6.0 × 109CFU (LD50)，觀察1 w內所有小鼠發病率和死亡率，并記錄小鼠臨床特征和死亡情況.

1.2.6 血清學保守性和細菌表面表達分析 根據基因保守序列設計特異性引物，用PCR方法鑒定HbpB基因在各血清型中的保守性.HbpB基因擴增，上游引物：5’-aaaggatccccaataccagattcaggaacattg-3’，下游引物：5’-aaactcgagaaatgttttaattgcagataaccaaaa-3’.擴增條件為：94℃/5 min；94℃/30 s，58℃/30 s，72℃/2 min，循環30次；72℃/10 min.擴增產物長度為1 695 bp.HPS洗后重懸，加于HbpB血清(1∶50)于4℃作用1 h，免疫前的血清作陰性對照.再加百倍稀釋的FITC熒光二抗于4℃作用1 h，2%多聚甲醛固定，最后間接免疫熒光檢測，使用流式細胞儀檢測的HPS菌數為1.0 × 106個.

2 結果

2.1 生物信息學分析及表達純化IROMP

應用蛋白質亞細胞定位預測軟件PSORT(http://www.psort.org/)預測所有HPS編碼蛋白，結果顯示55個蛋白預測為外膜蛋白.通過生物信息學分析、抗原表位預測[10]，從中選擇10個蛋白評價其免疫原性.這10個外膜蛋白中5個在體外表達成功，其中參與鐵離子代謝的外膜蛋白有3個：IROMP1、IROMP B和HbpB，這3種鐵調節外膜蛋白成為本實驗研究的對象.克隆表達其重組蛋白，SDS-PAGE電泳結果顯示IROMP1、IROMP B和HbpB均表達在包涵體中.

2.2 重組IROMP蛋白誘導的體液免疫

為評價重組IROMP誘導特異性體液免疫應答的能力，ELISA法檢測其免疫血清中IgG抗體水平，結果顯示IROMP1、ROMP B、HbpB誘導的特異性IgG抗體明顯高于陰性對照組(p<0.001)(圖 1).為進一步了解其誘導的免疫應答類型，ELISA檢測其IgG1和IgG2a抗體亞類，結果見圖2，IROMP1和HbpB誘導的IgG1亞類抗體效價顯著高于IROMP B抗體效價，且3種重組蛋白誘導的IgG2a亞類抗體效價也都明顯.總之，從誘導體液抗體水平看HbpB效果最好.

圖1 重組IROMP誘導的體液免疫應答Fig.1 The induced immune responses of recombinant IROMPs

圖2 重組IROMP誘導的抗體亞型檢測Fig.2 Subclass analysis of the induced immune responses of recombinant IROMPs

2.3 IROMP調理吞噬試驗

實驗結果顯示，滅活HPS疫苗的高免血清有84%殺菌活性，陰性血清則不足30%.和陽陰性對照相比，IROMP1和IROMP B對HPS感染無保護力，而HbpB高免血清在體外能明顯抑制HPS生長(圖 3)，能誘導較高調理吞噬活性，在此方面提供的保護效果與滅活疫苗相當.

圖3 重組IROMP誘導的調理吞噬活性Fig.3 Opsonophagocytosis bactericidal activity of specific antibodies elicited by recombinant IROMPs

2.4 攻毒保護試驗和被動免疫試驗

小鼠攻毒試驗結果表明，感染HPS后所有陰性和空白對照組小鼠2 d內死亡，而HbpB能較好保護小鼠抵抗HPS感染，能提供90%保護率，與滅活苗效果相當 (圖 4)，其它兩種IROMP則保護效果不理想.為進一步驗證HbpB保護力是由抗體介導的，小鼠靜脈注射HbpB高免血清后觀察其保護效率.結果顯示，對照陽性血清(HPS滅活苗)和陰性血清分別提供60%和0%保護率，而HbpB高免血清提供50%保護率，保護效果較理想，有開發成為疫苗的潛力.

圖4 重組IROMP的小鼠保護力試驗Fig.4 Effects of immunization of recombinant IROMPs on survival of mice

2.5 HbpB在各血清型中保守性和在細菌表面的表達研究

為驗證HbpB蛋白在其它血清型上的保守性，我們采集了幾乎全部血清型的HPS菌株(15種)[11]，并對其HbpB基因進行PCR擴增，PCR結果顯示HbpB在HPS各血清型上呈保守現象(圖 5).為確證HbpB蛋白的亞細胞定位，證實其是否在外膜上表達，HPS經HbpB血清及熒光二抗作用后進行間接免疫熒光檢測，結果顯示在陽性血清樣品中均能檢測到熒光信號，顯示出細菌輪廓，而陰性血清中未能觀察到熒光(圖 6)，證實HbpB確在HPS外膜表面表達.

1～15代表HPS的1～15血清型

圖6 間接免疫熒光檢測HbpB亞細胞定位(A)及陰性血清對照(B)Fig.6 Indirect immunoinfluscent assay(IFA) analysis of recombinant IROMPs(A)in HPS cells with negative serum as a control(B)

3 討論

革蘭氏陰性菌的外膜蛋白在鑒定和發掘亞單位等新型疫苗時潛力巨大，隨著蛋白質組學和免疫學技術的發展，免疫蛋白質組學為從細菌外膜蛋白中鑒定新型免疫原性蛋白提供了強大工具.但由于蛋白質組學方法本身的局限性，一些外膜蛋白無法運用其技術鑒定出來，比如一些低豐度蛋白和疏水蛋白等.對于蛋白質組學無法鑒定出的那部分外膜蛋白，可通過反向疫苗學方法對其進行篩選和鑒定，以補充免疫蛋白質組學的研究結果.蛋白質組學和反向疫苗學技術的綜合運用，可發掘出更多效果更好的免疫原性外膜蛋白，為一些細菌疫苗開發打下基礎.而鐵調節外膜蛋白IROMP具有很好的開發成疫苗的潛力，它們都表達在細菌外膜上，都具抗原性，能誘導免疫應答阻斷細菌的鐵攝取系統.IROMP誘導免疫保護的研究在許多革蘭氏陰性菌上均有過報道，比如大腸桿菌、巴氏桿菌、傷寒桿菌、腦膜炎奈瑟菌等.

通過反向疫苗學方法預測的HPS外膜蛋白中，體外表達成功的外膜蛋白有5個，其中有3個是IROMP，它們均表達在包涵體中，血清學試驗證實它們均能引起特異性免疫應答.為了解其誘導的免疫應答類型，需檢測IgG1和IgG2a抗體亞類.IgG2a和IgG1抗體亞類分別代表Th1免疫應答和Th2免疫應答，而Th1和Th2型為Th細胞分化的2個方向，Th1可分泌多種細胞因子如干擾素促進CTL反應即細胞免疫傾向，而Th2可分泌細胞因子IL-4以促進抗體產生即體液免疫傾向，當然這兩種方向只是偏向而已.盡管IgG1和IgG2a抗體亞類檢測不能準確定量不同的免疫類型，但一般用IgG1/IgG2a來評價免疫原性蛋白誘導的免疫應答是偏向于哪種應答.通過本實驗研究可證實IROMP在小鼠體內更傾向誘導體液免疫一些.

將3種重組蛋白IROMP1， IROMP B， HbpB分別進行血清抗體檢測、調理吞噬試驗、小鼠攻毒試驗和被動免疫試驗，結果很明顯，在這3種蛋白中，HbpB無論是在誘導抗體水平、調理吞噬活性，還是在提供的抗HPS的保護力上，都是最優的.HbpB在已完成的各項試驗中，在血清抗體效價、高免血清殺菌率、攻毒試驗保護率等方面，都與HPS滅活疫苗的指標不相上下，實驗結果還證實，HbpB在HPS各血清型上都存在，相當保守，同時間接免疫熒光檢測結果確證HbpB表達在HPS細胞外膜上.所有研究結果都表明鐵調節外膜蛋白HbpB具有良好的免疫原性，能夠提供較好的保護力，是研究開發HPS新型疫苗的理想目標蛋白.

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Immunogenicity of iron-regulated outer membrane protein ofHaemophilusParasuis

HAN Duandan1， ZHOU Mingguang2

(1.Wuhan Donghu College， Wuhan 430077； 2. Wuhan Keqian Animal Biological Co.， Ltd， Wuhan 430070)

To develop novel effective vaccines againstHaemophilusparasuis(HPS)， the reverse vaccinology and immunoproteome-based approaches were used to predict and analyze the outer membrane proteins of HPS. Three iron-regulated outer membrane proteins (IROMP) were screen-ed and identified for the further study on their immunogenicities. Vaccination with the IROMPs(HbpB， IROMP1， IROMP B)resulted in a significant increase in mixed antibody response (IgG1 and IgG2a). Among them， immunization of mice with HbpB conferred 90% survival against lethal HPS challenge. In addition， the hyperimmune sera against HbpB efficiently killed the bacteria by opsonized phagocytosis and significantly protected mice against HPS infection in the experiment of passive immunization. The results indicated that the IROMP HbpB would be an immune protein candidate for developing novel subunit vaccines against HPS．

Haemophilusparasuis； iron-regulated outer membrane proteins； reverse vaccinology； immunogenicity

2015-08-25.

1000-1190(2015)06-0925-04

S852.43

A

*E-mail: 28051164@qq.com.