氧化應激在 TRAIL誘導Hela細胞凋亡中的作用

葉記林，于有江，吳愛蓮，王冬燕，彭建明，劉永春，劉延慶

(1．揚州市職業大學醫學院，江蘇 揚州 225009;2．江蘇省蘇北人民醫院兒科，江蘇 揚州 225000;3．揚州大學醫學院，江蘇揚州 225001)

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是一種具有良好前景的治療腫瘤的藥物，它能選擇性誘導多種腫瘤細胞凋亡，而對正常組織無明顯損傷。但較高濃度的TRAIL對人體正常細胞也有損傷，多種腫瘤細胞株對TRAIL誘導的凋亡并不敏感等問題阻礙了 TRAIL的應用［1]。弄清TRAIL誘導癌細胞凋亡的發生機制是突破點。近年來，越來越多的實驗證明，TRAIL誘導多種腫瘤細胞凋亡與氧化應激密切相關［2－3]。然而TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的氧化應激作用的具體機制研究很少，現以Hela細胞為模型探討TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的氧化應激作用，為臨床腫瘤治療提供參考。我們以往的實驗證實TRAIL誘導Hela細胞凋亡中線粒體途徑發揮了重要作用［6]，本實驗擬進一步探討氧化應激作用與線粒體途徑的關系。

1 材料與方法

1．1 材料 人宮頸癌 Hela細胞購自中國科學院上海細胞生物庫。Human TRAIL蛋白購于 Millipore公司，DMEM培養基購于Gibco公司，小牛血清購于杭州四季青公司，MTT和二甲基亞砜(DMSO)購于Amresco公司，N－乙酰半胱氨酸(NAC)購于Calbiochem公司，GSH、MDA檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，Bcl-2、Cyt C、DR 4、DR 5 抗體購自Cell Signal公司，MRC－1024型激光共聚焦儀和流式細胞儀為美國BIO－RAD公司產品。

1．2 實驗方法

1．2．1 細胞培養 Hela細胞用含10% 小牛血清的DMEM 培養液，在 37℃，5%CO2飽和濕度下培養。選擇對數生長期的細胞用于實驗。設生理鹽水對照組、TRAIL組(終濃度為40μg·L－1)、抗氧化劑 NAC 組(終濃度為10 mmol·L－1)、TRAIL+NAC組(先用10 mmol·L－1NAC預處理細胞2 h，然后加入 TRAIL)。當細胞處理時，換含2%小牛血清的培養液進行培養。

1．2．2 MTT法檢測細胞增值的抑制 取對數生長期細胞，以2×105/孔細胞接種于24孔板。分組處理細胞，每組設6個復孔。藥物作用后每孔加入0．5 g·L－1MTT 300 μL，孵育 4 h后棄去培養液，每孔加入 DMSO 500μL，振蕩10 min，完全顯色后，轉移至96孔板，用酶標儀在570/630 nm波長測吸光度OD值(OD值代表相對活細胞數)。

1．2．3 分光光度比色法分析 GSH、MDA含量的變化 分組處理細胞，將收集的細胞用預冷的 PBS(pH 7．2)重懸，超聲破碎細胞制成勻漿液，4℃ 離心，取上清液，采用分光光度比色法檢測細胞勻漿液總蛋白含量，GSH、MDA含量檢測嚴格按試劑盒說明書進行。

1．2．4 流式細胞儀測定胞內活性氧水平 參照文獻［7]方法，細胞用10μ mol·L－1DCFH-DA 在 37℃ 孵育45 min，然后分組加藥處理細胞。細胞孵育后用PBS漂洗，用流式細胞儀以488 nm為激發波長，530 nm為發射波長測定細胞內的綠色熒光強度。每份樣品記10 000個細胞。

1．2．5 Rh-123結合激光共聚焦檢測線粒體膜電位(ΔΨm) 按照文獻［6]的方法進行，收集處理后的各組細胞用PBS洗滌2次，然后加入羅丹明123(Rh-123)，使其終濃度為 5 mg·L－1，37℃ 閉光孵育20 min，再用PBS洗3遍，激光共聚焦顯微鏡于505 nm激發光、534 nm發射光實時監測細胞胞內熒光強度。統計每個樣品中所有受檢測細胞的熒光強度值的均值，該值即反映相對ΔΨm的強度。

1．2．6 Western blot檢測 Bcl-2、Cyt C、DR 4 和DR 5

收集處理后的各組細胞。按常規方法提取蛋白質，恒壓進行SDS電泳分離，然后電轉到 PVDF膜上，分別與 Bcl-2兔多抗、鼠抗人 DR 4單抗、鼠抗人DR 5單抗、4℃ 孵育過夜，再加入羊抗兔 IgGHRP室溫孵育1 h，將膜洗滌干凈后，加 TMB顯色液顯色、攝影。一部分細胞參照文獻分離［8]細胞質蛋白。以 Cyt C鼠單抗為一抗檢測 Cyt C蛋白含量。

1．2．7 統計與分析 應用 SigmaPlot 12．0及 Excel 2003統計軟件，所有實驗重復3次或以上，結果以x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩獨立組間比較采用LSD－t檢驗。以P＜0．05為差異有顯著性。

2 結果

2．1 TRAIL對 Hela細胞生長的影響 40μg·L－1TRAIL作用于Hela細胞12 h后，對細胞的生長具有顯著的抑制作用 (P＜ 0．01)。40μg·L－1TRAIL+10 mmol·L－1NAC組雖然也對細胞生長有抑制作用，但與單獨 TRAIL組比較，NAC能明顯減弱 TRAIL對 Hela細胞的生長抑制作用，P=0．000。而單獨的 NAC對細胞的生長沒有明顯影響(圖1)。

圖1 TRAIL對Hela細胞增殖的抑制作用(x ±s，n=4)

2．2 TRAIL引起細胞GSH、MDA含量的變化

由表1可知，單獨40μg·L－1TRAIL作用組，隨著作用時間的延長，Hela細胞內抗氧化因子 GSH含量與對照組比較，從2 h開始均有顯著降低 (P＜0．01)，且呈現時間依賴性;氧化應激產物 MDA含量在TRAIL作用2 h時基本不變，只是從4 h開始逐漸降低，且呈現時間依賴性。

40 μg·L－1TRAIL+10 mmol·L－1NAC 組，抗氧化因子 GSH含量從4 h開始才略有降低，到8 h GSH 含量仍然有(116．2 ± 4．7)mg·g－1Pro，明顯高于單獨 TRAIL處理8 h GSH含量(57．7±1．2)mg·g－1Pro，與對照組相比相差不多;而 MDA含量隨著作用時間延長基本維持不變。

表1 TRAIL，NAC+TRAIL作用不同時間引起GSH、MDA含量變化(x ±s，n=4)

2．3 TRAIL引起細胞內 ROS含量變化 由圖2可知，以DCFC-DA轉化生成的平均熒光強度代表ROS含量，40μg·L－1TRAIL作用的細胞從2 h開始細胞內綠色熒光強度明顯提高，產生的ROS量隨著作用時間的延長不斷升高，到4 h時ROS的含量已經達到了對照組的2．33倍。而 NAC能完全抑制TRAIL導致的細胞內 ROS的含量升高(數據未顯示)。

圖2 流式細胞儀檢測TRAIL引起細胞內ROS的變化

2．4 TRAIL引起 Hela細胞 ΔΨm 的變化 如圖3所示，Rh-123熒光強度值反映的是線粒體膜電位(ΔΨm)的大小。TRAIL處理4 h組與對照組相比ΔΨm變化不大，隨著處理時間的延長，ΔΨm逐漸降低，呈現明顯的時間依賴性 (P＜0．01)。而NAC能完全抑制TRAIL引起的ΔΨm下降。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測細胞線粒體的Rh-123熒光強度值變化(x ±s，n=4)＊＊

2．5 TRAIL 引起 Hela 細胞 Bcl-2、Cyt C、DR4、DR5蛋白量的變化 圖4(a)、4(b)顯示，與對照組相比，40μg·L－1TRAIL作用8 h后能明顯下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提高死亡受體DR 5的表達，引起細胞線粒體內Cyt C向細胞質的釋放，但對死亡受體DR 4的表達基本沒有影響。而 NAC能完全抵消TRAIL引起的這些蛋白量的改變。

圖4 TRAIL處理 Hela細胞中的Bcl－2、Cyt c、DR4、DR5蛋白量的變化

3 討論

近年的研究證實，氧化應激與TRAIL引起的多種細胞凋亡密切相關［2－3]然而 TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的氧化應激作用的具體機制還不清楚。本實驗結果顯示TRAIL對Hela細胞的生長具有顯著的抑制作用(圖1)，我們已經證實這種抑制主要是TRAIL通過誘導 Hela細胞凋亡進行的［4]。抗氧化劑NAC能明顯減弱TRAIL對 Hela細胞的生長抑制作用，與Gatsinzi等報道的NAC能完全抑制多種藥物聯合TRAIL誘導的細胞凋亡作用結果相似［8]。這些表明氧化應激在TRAIL引起的Hela細胞凋亡中起重要作用。

經TRAIL處理后，Hela細胞內抗氧化代表物質GSH含量從2 h開始均有顯著降低(表1)，活性氧ROS的含量也是從2 h開始隨著作用時間的延長不斷升高。氧化應激主要產物 MDA含量在TRAIL作用2 h時基本不變，只是從4 h開始逐漸升高。而抗氧化劑NAC能基本消除TRAIL對Hela細胞產生的氧化應激作用 (表1)。GSH、ROS含量變化先于 MDA含量變化。這表明 TRAIL可以使細胞的氧化應激效應增強。而這可能是因為TRAIL首先抑制了抗氧化物質 GSH的生成，導致細胞清除ROS能力降低，使得ROS水平急劇升高，從而引發脂質過氧化反應而導致MDA含量的升高和細胞增值的抑制，與先前的報道相一致［7]。

在許多細胞的凋亡過程中，ROS的增加與線粒體凋亡途徑關系密切［7－8]。而 TRAIL誘導 Hela細胞凋亡的可能途徑之一是通過線粒體進行的［6]。本實驗進一步探討了 ROS的增加與線粒體凋亡途徑的關系。TRAIL處理4 h組與對照組相比線粒體膜電位 ΔΨm變化不大，到6 h時 ΔΨm明顯降低(圖4)。另外，TRAIL作用8 h后能明顯下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，引起細胞線粒體內Cyt c向細胞質的釋放(圖4)。實驗結果表明 ROS的升高 (TRAIL處理2 h時開始不斷升高)是 TRAIL誘導Hela細胞凋亡的早期事件，要先于 ΔΨm下降 (TRAIL處理 6 h時開始明顯降低)的發生。而NAC能抑制TRAIL引起的ΔΨm下降，也能完全抵消TRAIL引起的這些蛋白量的改變。提示ROS升高可直接或間接損傷線粒體而引發線粒體凋亡途徑。其機制可能是ROS升高引起抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降和細胞線粒體氧化損傷，使線粒體膜電位下降，引起Cyt C等凋亡蛋白的釋放，從而通過激活Caspases通路導致細胞凋亡。

TRAIL作用的主要途徑是與死亡受體DR 4和DR 5結合，招募FADD(Fas-associated death domain protein)，并進一步激活 Caspase-8，形成死亡誘導信號復合物，最后將活化信號傳遞并激活 Caspase-3，從而發揮誘導細胞凋亡的生物學功能，這是TRAIL凋亡的非線粒體途徑［9－10]。本實驗結果顯示TRAIL處理后能上調死亡受體 DR 5的表達，但對死亡受體DR 4的表達基本沒有影響。而 NAC能完全抑制 TRAIL所引起的 DR 5的升高 (圖4)。提示TRAIL誘導Hela細胞凋亡的可能途徑之一是通過ROS途徑上調DR 5表達而進行的，與DR 4無關，這與以往的報道類似［11－12]。

綜上所述，氧化應激在 TRAIL引起的 Hela細胞凋亡中起著重要作用，其機制可能是TRAIL導致抗氧化物質 GSH含量降低，清除 ROS能力降低，ROS水平急劇升高。ROS升高一方面導致抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降和細胞線粒體氧化損傷而激活線粒體凋亡通路。另一方面通過上調死亡受體DR 5表達而執行非線粒體凋亡途徑。本實驗為將TRAIL用于臨床腫瘤治療提供了一定的實驗參考，也為TRAIL凋亡增敏劑的探索提供了研究基礎。

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