不同濃度蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞增殖和周期的影響

楊映映 秦甜甜 錢樹樹 彭 林 劉莉嘉 白松棉 王如峰 蔣 燕 胡秀華

(北京中醫藥大學，北京，100029)

不同濃度蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞增殖和周期的影響

楊映映 秦甜甜 錢樹樹 彭 林 劉莉嘉 白松棉 王如峰 蔣 燕 胡秀華

(北京中醫藥大學，北京，100029)

目的：探討不同濃度蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞增殖、周期的影響。方法：光學顯微鏡下觀察蜜炙紫菀水煎劑對LOVO細胞形態的影響；利用MTT觀察藥物處理后對LOVO細胞的生長增殖情況的影響；采用流式細胞術檢測蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞增殖周期的影響。結果：光學顯微鏡和MTT結果發現，低濃度的蜜炙紫菀水煎劑(≤20 mg·mL-1)對大腸癌LOVO細胞的增殖具有明顯的促進作用，增殖率可達到99.7%；光學顯微鏡下可見細胞生長狀態良好，細胞死亡少。高濃度的蜜炙紫菀水煎劑(>20 mg·mL-1)對大腸癌LOVO細胞的增殖具有明顯的抑制作用，抑制率達到80.34%以上；光學顯微鏡下可見細胞的形態改變，細胞大量死亡。流式細胞術結果顯示，蜜炙紫菀水煎劑可以使大腸癌LOVO細胞周期各個時相(G1期、S期和G2期)的細胞所占百分數發生改變。10 mg·mL-1和20 mg·mL-1的蜜炙紫菀水煎劑使S期中細胞所占的百分數增加；30 mg·mL-1蜜炙紫菀水煎劑使S期細胞所占的百分數明顯減少，G2期細胞百分數明顯增加。結論：蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞增殖的作用是雙向的，低濃度(≤20 mg·mL-1)的蜜炙紫菀水煎劑具有明顯的促進LOVO細胞增殖作用；高濃度(>20 mg·mL-1)的蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞的增殖具有明顯的抑制作用，且可能是通過G2期阻滯來抑制大腸癌LOVO細胞增殖的，這為大腸癌的臨床治療提供了新的思路。

大腸癌LOVO細胞；蜜炙紫菀水煎劑；細胞增殖；細胞周期

大腸癌包括結腸癌和直腸癌，是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人類的健康。目前，在全世界范圍內大腸癌的發病率男女均處于惡性腫瘤第3位，其中西方發達國家大腸癌的發病率處于第2位。且隨著生活水平的提高，飲食結構的變化，大腸癌的發病率呈上升的趨勢。手術治療作為大腸癌治療的首選方法，5年生存率僅在50%左右。近年來隨著吻合器的廣泛應用及各種新式化療藥物的出現，國際上很多學者建議采用在手術的基礎上輔助以化療、放療、同步放化療、生物治療和中醫藥治療等在內的一系列綜合治療手段[1]。紫菀為菊科植物，味苦、辛、甘，性微溫，歸肺經。功效潤肺、化痰、止咳，可用于咳嗽有痰諸證。在中醫學中將大腸癌分為氣滯血瘀、痰濁阻滯、濕熱蘊毒等類型，說明大腸癌的發生與痰濁關系密切，紫菀或可通過其化痰功效對大腸癌的發生產生抑制作用?，F代研究[2-7]顯示，紫菀中的一些化學成分，如表木栓醇、環狀五肽(AstinA、B、C)、鹵代環狀五肽Asterin(2)、紫菀多糖、槲皮素、大黃素、微量元素(Ca、Mn、Se、Fe、Cu、Mn、Mo)均具有抗腫瘤活性。本實驗基于中醫“肺與大腸相表里”的理論，依據紫菀的化痰功效及其現代研究，采用細胞培養、MTT法以及流式細胞術來探討入肺經的中藥蜜炙紫菀對大腸癌LOVO細胞增殖和周期的影響，為深入研究蜜炙紫菀治療大腸癌提供實驗基礎。

1 資料

1.1 藥品及試劑 胎牛血清(Gibco，美國)，F-12K培養基(Gibco)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)，生理鹽水，碘化丙啶(PI，Sigma公司)，RNA酶(Sigma公司)，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽噻唑藍(MTT，Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)。蜜炙紫菀(同仁堂)購自北京中醫藥大學國醫堂門診部；LOVO細胞購自北京協和醫學院基礎學院細胞中心。

1.2 儀器 倒置顯微鏡(OLYMPUS日本)，酶標儀(Bio-Tek美國)，流式細胞儀(BD美國)，CO2培養箱(BINDER德國)，96孔細胞培養板、細胞培養瓶(Corning公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 將同仁堂生產的蜜炙紫菀用精密電子天平秤取60 g，按照常規中藥煎煮方法煎煮。待煎至約100 mL時將煎劑倒入150 mL的燒杯中，用培養皿蓋住燒杯口(此燒杯和培養皿均經無離子水浸泡、高壓滅菌)，進行濃縮，直至30 mL。然后將其轉移至超凈工作臺，轉移至無菌離心管進行1 000 r/min離心，取上清液。取少許上清液加入培養基，置37 ℃，5% CO2的培養箱內靜置培養以檢菌。24 h后觀察培養基，結果顯示無菌后，密閉保存上清液備用。制取的蜜炙紫菀水煎劑濃度為2 g·mL-1，作為原液。

2.2 細胞培養及光學顯微鏡下觀察 結腸癌LOVO細胞株由北京協和醫學院基礎學院細胞中心提供，用含10%胎牛血清的F-12K培養基，置37 ℃，5%CO2的培養箱內靜置培養，取對數生長期的LOVO細胞以每孔1.3×105·mL-1接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，置37 ℃，5%CO2的培養箱內培養24 h后換液，加入含不同質量濃度蜜炙紫苑水煎劑的培養基(終濃度分別為5、10、20、40、50、60、70、80 mg·mL-1)，同時設置陰性對照孔，每個組設6個平行孔，繼培養48 h后，光學顯微鏡下觀察細胞的形態和密度。

2.3 MTT法測定蜜炙紫菀水煎劑對LOVO細胞的增殖和抑制作用 取對數生長期的LOVO細胞以每孔1.3×105·mL-1接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，置37 ℃，5%CO2的培養箱內培養24 h后換液，加入含不同質量濃度蜜炙紫苑水煎劑的培養基(終濃度分別為0.2、0.8、3.2、5、6.4、10、20、40、50、60、70、80 mg·mL-1)，同時設置陰性對照孔，每個組設6個平行孔，繼續培養48 h后每孔加入質量濃度為5 g·mL-1的MTT溶液100 μL，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，放入酶標儀上測定570 nm處的光吸收值，計算細胞生長增殖率和抑制率，細胞增殖率(%)=(實驗組平均吸光度值-對照組平均吸光度值)/對照組平均吸光度值×100%；抑制率(%)=(1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

2.4 流式細胞儀檢測細胞增殖周期 將對數生長期的LOVO細胞以2×105個·mL-1接種于25 cm2培養瓶中，待80%細胞匯合成片后，棄培養瓶中液體，實驗組加入不同濃度的蜜炙紫菀水煎劑，終濃度分別為10、20、30 mg·mL-1，并設立對照組，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養48 h后，收集細胞；用冷生理鹽水洗滌細胞(1 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入4 ℃預冷的75%乙醇，于4 ℃固定過夜。取固定好的細胞，用4 ℃生理鹽水洗兩次，分別加入50 μg·mL-1的PI和50 μg·mL-1的RNA酶1∶1混合液1 mL，避光10 min后上機檢測分析細胞的增殖周期。

3 結果

3.1 光學顯微鏡下不同濃度的蜜炙紫菀水煎劑對LOVO細胞生長狀態的影響 實驗結果如圖1所示，對照組LOVO細胞大小均勻，形態完好，細胞膜舒展，未見細胞核固縮，死亡細胞較少，細胞生長狀態良好；不同質量濃度的蜜炙紫菀水煎劑處理LOVO細胞48 h后，LOVO細胞的形態與對照組相比，5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、20 mg·mL-1蜜炙紫菀水煎劑組細胞大小均勻，密度較大，形態完好，細胞膜舒展，生長狀態良好；其他質量濃度處理組(40 mg·mL-1、50 mg·mL-1、60 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1)發現LOVO細胞有不同程度的細胞形態改變，細胞中空泡增加，細胞體積變小，細胞間隙變大，細胞變圓透亮，細胞膜皺縮，可見不同程度的細胞脫落，同時發現隨著蜜炙紫菀水煎劑的質量濃度的增高，LOVO細胞生長狀態越差，細胞死亡越多。

圖1 不同質量濃度紫菀水煎劑作用大腸癌LOVO細胞48 h后對其形態的影響

3.2 低濃度蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞的生長具有促進作用 分別用不同濃度的蜜炙紫菀水煎劑處理細胞(終濃度分別為0.2 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、3.2 mg·mL-1、5 mg·mL-1、6.4 mg·mL-1、10 mg·mL-1、20 mg·mL-1)，同時設立對照組。MTT結果如表1所示，與對照組相比，在質量濃度為0.2～10 mg·mL-1之間的蜜炙紫菀水煎劑處理細胞48 h后，發現對LOVO細胞的增殖具有明顯的促進作用，且隨著質量濃度的增加，促進增殖的能力越強，增值率分別是5.45%，10.82%，19.40%，23.96%，40.88%，99.70%，在10 mg·mL-1時增值率達到最高99.70%，統計學分析顯示P<0.01，差異具有統計學意義。蜜炙紫菀水煎劑濃度達到20 mg·mL-1時增值率由10 mg·mL-1的99.70%降低到36.56%，但和對照組相比P<0.01，差異具有統計學意義。MTT結果和我們在倒置顯微鏡下觀察到的細胞生長狀態相符。

表1 MTT測定蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞的增殖的影響

注：與空白對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。

3.3 高濃度蜜炙紫菀水煎劑對LOVO細胞增殖的影響 如3.2結果中表1所示，與對照組相比，在質量濃度20 mg·mL-1之前，蜜炙紫菀水煎劑對LOVO的增殖有明顯的促進作用，并且在10 mg·mL-1時達到峰值。然后利用終濃度分別為40 mg·mL-1、50 mg·mL-1、60 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1的蜜炙紫菀水煎劑處理細胞48 h后，MTT結果顯示如表2所示，與對照組相比，不同濃度實驗組均對LOVO細胞的生長增殖有不同程度的抑制，抑制率分別為80.34%、89.50%、90.76%、90.80%、94.90%，統計學分析顯示P<0.01，與對照組相比差異具有統計學意義。MTT結果和我們在倒置顯微鏡下觀察到的細胞生長狀態相符。

表2 MTT法測定蜜炙紫菀水煎劑對LOVO細胞的抑制情況

注：與空白對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。

3.4 流式細胞術檢測蜜炙紫菀水煎劑對LOVO細胞周期的影響 流式細胞術分析結果如表3與圖2所示，0、10、20、30 mg·mL-1蜜炙紫菀水煎劑作用48 h后，隨著質量濃度的增加細胞增殖周期中的三個時期G1期、S期和G2期的細胞所占百分數有不同的改變，其中G1期細胞所占的百分數平均值分別為74.50%、73.84%、58.91%、56.12%，經T檢驗發現與對照組差異有統計學意義(P<0.05)。S期中細胞所占百分數平均值分別為14.04%、23.86%、18.98%、11.82%。經T檢驗后發現與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.01)；G2期中細胞所占百分數平均值分別是10.46%、5.64%、23.78%、32.26%，與對照組相比P<0.01，具有統計學意義。

表3 流式細胞術檢測LOVO細胞周期中各時相所占百分數

注：與空白對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。

圖2 不同質量濃度的蜜炙紫菀水煎劑對LOVO細胞周期中各期細胞百分數的影響

4 討論

研究發現多種祛濕化痰藥物可以用于肺癌的治療，其中，紫菀水提物能選擇性地抑制荷S180小鼠腫瘤生長[8-9]；紫菀多糖能抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖和生長，誘導SCG-7901細胞株的凋亡[10]；Du L等[11]從紫菀提取物中分離純化得到一種多聚糖類物質，命名為ATP-2，該物質能抑制神經膠質瘤C6的增殖。

本實驗基于紫菀的化痰功效和抗腫瘤活性，探討蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞增殖的影響。實驗結果表明蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞增殖的作用是雙向的，低濃度的蜜炙紫菀水煎劑(≤20 mg·mL-1)對大腸癌LOVO細胞的增殖具有明顯的促進作用，并在10 mg·mL-1時促進作用最明顯，達到了99.70%；高濃度的蜜炙紫菀水煎劑(>20 mg·mL-1)對大腸癌LOVO細胞的增殖有明顯的抑制作用，在40 mg·mL-1時抑制率即可以達到80.34%，光學顯微鏡下可見細胞的形態改變，細胞大量死亡。50～80 mg·mL-1的蜜炙紫菀水煎劑和40 mg·mL-1蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌細胞的抑制率差異沒有統計學意義(P>0.05)。由此確定蜜炙紫菀水煎劑在質量濃度20～40 mg·mL-1的范圍內對大腸癌細胞具有細胞毒性，可以抑制大腸癌細胞的增殖。

從中草藥中提取的抗腫瘤藥物，其細胞毒性作用的主要機制是誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡?？鼓[瘤藥物可以通過誘導細胞周期阻滯而抑制細胞增殖[12]。一個完整的細胞周期包括間期(G1期、S期和G2期)和分裂期(M期)，藥物可使細胞周期阻滯在不同時期，包括G1期阻滯、G1/S期阻滯、G2期阻滯和G2/M期阻滯等。研究發現抗腫瘤藥物常通過引起腫瘤細胞DNA損傷而導致細胞周期阻滯。有DNA損傷的細胞常被阻滯在G1期，防止受損的DNA進入S期復制；或被阻滯在G2期，以防止在M期進行異常分裂[13]。p53基因與G1期阻滯關系密切，缺失p53的腫瘤細胞不能啟動G1期關卡，因而在抗腫瘤藥物使腫瘤細胞DNA受損后主要表現為G2期阻滯[14]。而在所有腫瘤細胞中，50%以上有p53基因功能缺陷[15]。這種情況下，G2期阻滯就成了抗腫瘤藥物使腫瘤細胞發生周期阻滯的重要途徑。本實驗研究發現蜜炙紫菀水煎劑可以使大腸癌LOVO細胞周期各個時相(G1期、S期和G2期)的細胞所占百分數發生改變。與對照組相比，10 mg·mL-1和20 mg·mL-1蜜炙紫菀水煎劑實驗組細胞周期中S期中細胞所占百分數增加，具有統計學意義，說明細胞增殖處于旺盛時期，這與光學顯微鏡結果及MTT結果相一致。但是30 mg·mL-1蜜炙紫菀水煎劑實驗組細胞周期中S期細胞所占百分數較對照組明顯減少，G2期細胞百分數明顯增加，細胞增殖周期可能停滯在G2期，這表明蜜炙紫菀水煎劑對大腸癌LOVO細胞的增殖的抑制作用，可能是通過G2期阻滯來完成的，由此我們推斷G2期可能是蜜炙紫菀水煎劑作用于大腸癌LOVO細胞的治療靶點。蜜炙紫菀水煎劑導致大腸癌細胞G2期阻滯是否和p53的表達相關，是我們進一步的研究重點。

由上可知，中藥紫菀在劑量范圍20～40 mg·mL-1內對大腸癌LOVO細胞的增殖具有抑制作用。在低濃度時(≤20 mg·mL-1)對大腸癌具有明顯的促進增殖作用，在高濃度(>20 mg·mL-1)時對抑制大腸癌LOVO細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并且很可能將其阻滯在G2期。這為中醫臨床用藥劑量的選擇提供了生物學基礎，但其作用于大腸癌LOVO細胞的分子機制仍有待深入探討。

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(2015-01-16收稿 責任編輯：張文婷)

Effects of Honey-fried Radix Asteris Decoction(HFRAD) on Cell Proliferation and Cell Cycle of Colorectal Cancer LOVO Cells

Yang Yingying, Qin Tiantian，Qian Shushu, Peng Lin, Liu Lijia, Bai Songmian, Wang Rufeng, Jiang Yan, Hu Xiuhua

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To explore the efficacy honey-fried Radix asteris decoction (HFRAD) of different concentration on cell cycle and proliferation of colorectal cancer LOVO cells.Methods:The changes of cellular morphology of LOVO cells treated with different concentration HFRAD were observed by optical microscopy. MTT colorimetric assay was applied to observe proliferation of LOVO cells; flow cytometry was used to analyze cell cycle of LOVO cells. Results:MTT results indicated that proliferation of LOVO cells treated with low concentration HFRAD(≤20mg·mL-1)has been obviously promoted, and the cell proliferation rate could be up to 99.7%. Moreover, normal cellular morphology and membrane structure were observed by optical microscopy. Compared with the low concentration groups, it was found that cell proliferation of LOVO cells treated with high concentration HFRAD (>20mg·mL-1) was obviously inhibited, the cell inhibitor rate can be up to above 80.34%. Optical microscopy results indicated that LOVO cells treated with high concentration HFRAD had lowest cell viability and the number of normal morphology cells can be significantly reduced. Flow cytometry results showed that the proportions of G1, S and G2 phase cells vary from different concentration HFARD and were significantly different from the control group. The proportion of S phase LOVO cells increased when treated with 10 and 20mg·mL-1HFRAD. However, it was also found that the proportion of S phase LOVO cells decreased and the proportion of G2 phase increased with 30mg·mL-1HFRAD. Conclusion:Different concentrate HFRAD has distinct efficacy on cell proliferation and cell cycle of LOVO cells. Cell proliferation of LOVO cells can be significantly promoted in concentration of HFRAD(≤20mg·mL-1). However, high concentration HFRAD(>20mg·mL-1) can inhibit cell proliferation. Moreover, inhibition of G2 phase might be due to high concentration HFRAD. Our findings can provide experimental evidences for HFRAD in clinical therapy of Colorectal cancer.

Colorectal cancer LOVO cells; Honey-fried Radix asteris decoction (HFRAD); Cell proliferation; Cell cycle

國家級大學生創新創業訓練計劃課題——基于“肺與大腸相表里”理論研究紫菀及其提取物對大腸癌細胞增殖和遷移的影響(編號：20131002602)；國家自然基金面上項目(編號：81274044)

胡秀華(1975.05—)，女，博士后，副教授，研究方向：中西醫結合基礎，Tel：(010)64286976，E-mail：xiuhuahu@126.com；蔣燕，女，博士，教授，研究方向：中醫基礎理論

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.11.032