隔藥灸對急性胃黏膜損傷家兔穴區線粒體及I型膠原蛋白的影響

周志剛 羅薇絮 張學強 覃 肯 竇傳字 吳煥淦

(1 上海中醫藥大學，上海，201203；2 江西中醫藥大學，南昌，330004)

針灸經絡

隔藥灸對急性胃黏膜損傷家兔穴區線粒體及I型膠原蛋白的影響

周志剛1,2羅薇絮2張學強2覃 肯2竇傳字1吳煥淦1

(1 上海中醫藥大學，上海，201203；2 江西中醫藥大學，南昌，330004)

目的：觀察隔藥灸對急性胃黏膜損傷家兔胃黏膜損傷指數、穴區局部線粒體結構、I型膠原蛋白表達的影響，從胃黏膜修復及腧穴局部能量代謝角度探討隔藥灸對急性胃黏膜損傷的起效機制。方法：新西蘭兔隨機分為正常組、模型組、隔藥灸組和西藥組。在成功制備急性胃黏膜損傷模型的基礎上，隔藥灸組取“后三里穴”進行治療，西藥組以硫糖鋁灌胃治療。各組治療干預結束后，留取胃黏膜和穴區局部組織，采用Guth法對各組的胃黏膜損傷指數進行評分，透射電鏡觀察后三里穴位局部組織線粒體形態結構，免疫組化法檢測穴區I型膠原蛋白的表達。結果：與正常組比較，模型組、西藥組和隔藥灸組家兔胃黏膜損傷指數均顯著升高(均P<0.01)；模型組穴區細胞線粒體空泡化，I型膠原蛋白表達降低(P<0.01)；隔藥灸組僅有少數線粒體水腫；西藥組線粒體數目少、出現腫脹，線粒體嵴不明顯。與模型組比較，隔藥灸組和西藥組胃黏膜損傷指數顯著下降(均P<0.01)，I型膠原蛋白表達升高(P<0.01或P<0.05)。隔藥灸組胃黏膜損傷指數低于西藥組(P<0.01)，I型膠原蛋白表達高于西藥組，但差異無統計學意義(P>0.05)。結論：隔藥灸能夠改善急性胃黏膜損傷家兔“后三里”穴穴區線粒體形態、提高急性胃黏膜損傷家兔后三里穴局部組織的I型膠原蛋白的表達，這可能是其修復胃黏膜損傷的起效途徑之一。

隔藥灸；急性胃黏膜損傷；線粒體；I型膠原蛋白；胃黏膜保護

灸法是以常見的艾絨為材料，點燃后直接或間接熏灼穴位的傳統療法，具有悠久的歷史。《扁鵲心書》就提到“保命之法，艾灼第一”，《醫學入門》中記載“凡病藥之不及，針之不到，必須灸之”。現代研究認為，艾灸時產生的溫熱刺激、紅外輻射以及艾灸生成物均是其起效的重要因素，而人體對溫熱刺激、紅外輻射等的反應是艾灸起效的科學基礎。艾灸的局部起效機制研究發現，施灸局部皮下和肌肉層都不同程度的受到施灸影響，從而產生溫度變化，并推測可能是溫度的變化改變了多種感受器的活動[1]。我們前期實驗結果顯示，隔藥灸可以提高急性胃黏膜損傷家兔穴區局部Na+/K+-ATP酶的活性，改善胃黏膜AB/PAS陽性層厚度，提示艾灸的修復效應與提高腧穴局部組織Na+/K+-ATP酶活性有關。ATP能量代謝和疾病的病理狀態密切相關，艾灸的近外紅光譜與腧穴自發的紅外光譜具有相似性，這可能引發共振，從而促進機體ATP能量代謝[2-3]。越來越多的證據顯示，艾灸發揮效應與穴區局部的能量代謝存在聯系。線粒體是合成ATP，參與能量代謝的主要場所，由ATP水解反應所釋放的生物能量可沿著蛋白質分子進行傳遞[4]。在此基礎上，選取急性胃黏膜損傷家兔模型，觀察胃黏膜損傷指數，隔藥灸對急性胃黏膜損傷家兔后三里穴區組織線粒體形態的影響以及I型膠原蛋白表達的變化，探討隔藥灸對急性胃黏膜損傷的起效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭家兔36只，體重約(2.2±0.5)kg，雌雄各18只，由上海中醫藥大學動物中心提供。家兔購回后適應性飼養7 d，飲食及一般情況正常者納入實驗。

1.2 主要試劑和儀器 艾絨、動物用艾條(南陽市臥龍漢醫艾絨廠)；硫糖鋁(四川錫成藥業有限公司，0.250g/片)；無水乙醇(上海高韻化工有限公司)；甲醛、戊二醛(上海國藥集團)；檸檬酸鈉緩沖溶液、中性樹脂(上?；鶢栴D)；I型膠原蛋白一抗、二抗(上?；鈱崢I有限公司)；組織脫水機(TP1020型，德國徠卡公司)；石蠟包埋機(EG1160型，德國徠卡公司)；組織切片機(RM2235型，德國徠卡公司)；封片機(CV5030型，德國徠卡公司)；電子天平(PL203型，梅特勒-托利多)；制冰機(上海久景制冷設備有限公司)；不銹鋼電熱重蒸餾水器(ZLSC-5型，上海申安醫療器械廠)；電恒溫水浴槽(DK-8A型，上海精宏實驗設備有限公司)；熒光顯微鏡(BA400型，MOTIC)；Motic圖像分析系統(麥克奧迪實業集團有限公司)；PHILIPS CM-120透射電鏡(PHILIP)。

1.3 模型制備 采用無水乙醇灌胃的方法制備家兔急性胃黏膜損傷模型[5]。造模前各組動物均禁食48 h，造模家兔采用無水乙醇(按2.35 mL/kg)灌胃，正常組用生理鹽水(按2.35 mL/kg)灌胃，24 h后各組家兔恢復普通飲食。造模結束后，隨機選取3只急性胃黏膜損傷模型家兔和1只正常組家兔，處死后取胃黏膜進行HE染色，光鏡下觀察胃黏膜損傷情況，判斷造模成功與否。

1.4 分組與治療 采用隨機數字表法將24只急性胃黏膜損傷家兔隨機分為模型組、隔藥灸組和西藥組，每組各8只，并與正常組家兔作對照。將家兔置于固定架內固定，保持雙后腿伸出，用剃毛器將家兔左、右后肢外側“后三里”穴毛發剃除，適應室溫10 min，按照以下方法進行干預處理：正常組和模型組，僅做家兔固定和剃毛，不進行任何治療；隔藥灸組，采用附子、肉桂、丹參等中藥，研成細粉，用適量黃酒調和拌成厚糊狀，采用模具壓制成直徑0.5 cm、厚0.3 cm大小的圓柱形藥餅。選取精制艾絨約90 mg，制作成小椎體狀艾柱。將制好的藥餅分別置于家兔雙側后三里穴上，上置艾柱，1次/d，每次灸6壯，連續治療7 d；西藥組，采用硫糖鋁灌胃治療。根據體表面積法計算硫糖鋁用量，1次/d，每次按25 mg/kg體重灌藥，連續治療7 d。腧穴定位方法：依據《實驗針灸學》穴位定位[6]，后三里穴位于家兔小腿背外側上1/5折點處，約當脛骨嵴后1 cm，腓骨頭下1.2 cm。

1.5 指標檢測

1.5.1 胃黏膜損傷指數評價 參考Guth法[7]進行潰瘍指數的計分：點狀出血為1分；線狀出血，長度<1 mm為2分；1～2 mm為3分；2～4 mm為4分；>4 mm為5分；寬度>1 mm時分值乘以2。

1.5.2 后三里穴組織線粒體結構觀察 取下“后三里”穴位置約0.1 cm×1 cm組織，置于2.5%戊二醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋并切片，染色后由透射電子顯微鏡進行觀察。

1.5.3 后三里穴組織I型膠原蛋白表達的檢測 取下“后三里”穴合適位置組織，約0.1 cm×1 cm，置于福爾馬林中固定48 h，逐級乙醇脫水，常規石蠟包埋，切片，脫蠟、水化，置于0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液中95 ℃抗原修復15 min，PBS洗滌，封閉，一抗、二抗孵育，透明，中性樹膠封片。

1.6 統計學方法 匯總數據，用SPSS 19.0軟件進行統計分析。對數據資料進行正態性檢驗，符合正態分布者，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；方差齊采用LSD和SNK法，方差不齊時用Tamhane's T2或Dunnett's T3法。不符合正態分布則采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 胃黏膜損傷指數 與正常組相比，模型組、隔藥灸組和西藥組家兔胃黏膜損傷指數均明顯升高，差異具有統計學意義(均P<0.01)；與模型組相比，隔藥灸組和西藥組胃黏膜損傷指數均顯著下降，差異具有統計學意義(均P<0.01)；隔藥灸組胃黏膜損傷指數低于西藥組，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組家兔胃黏膜損傷指數評分比較

注：與正常組比較，**P<0.01，與模型組比較，△△P<0.01。

2.2 “后三里”穴組織線粒體結構觀察 見圖1。

2.3 “后三里”穴組織I型膠原蛋白表達的比較 與正常組比較，模型組、隔藥灸組和西藥組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的陽性目標總面積明顯降低，差異存在統計學意義(均P<0.01)；與模型組比較，隔藥灸組和西藥組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的陽性目標總面積明顯升高，差異存在統計學意義(P<0.01，P<0.05)；隔藥灸組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的陽性目標總面積略高于西藥組，但無統計學意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組和西藥組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的積分光密度明顯降低，差異存在統計學意義(均P<0.01)；與模型組比較，隔藥灸組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的積分光密度明顯升高，差異存在統計學意義(P<0.01)；隔藥灸組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的積分光密度略高于西藥組，但無統計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1 各組家兔“后三里”穴組織線粒體結構觀察

組別例數陽性目標總面積(μm2)平均光密度值正常組8969.13±24.337883.75±1295.88模型組8648.25±53.82**4688.88±474.81*隔藥灸組8816.82±132.62**★6892.50±958.37△△西藥組8747.25±51.26**△5676.38±950.46*

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

腧穴是人體臟腑經絡氣血輸注于體表的特殊部位，是發生疾病時的反應點和針灸干預的刺激點。足三里為足陽明胃經之合穴，具有調理脾胃、補中益氣等功效，也是胃腑之下合穴，為主治胃腑病的首選穴，臨床主治與胃經有關的疾病。中醫古籍中關于足三里治療胃脘痛的記載有很多，如：明代針灸家徐鳳在《針灸大全》記載足三里“善治胃中寒”和“合治內府”，“肚腹三里留”又是《四總穴歌》對足三里主治作用的經典概括，《針灸精粹》也有記載，足三里能夠“理胃病，兼治腹中一切疾病”。已有研究發現，艾灸足三里穴能保護胃黏膜，誘導機體產生內源性保護物質，通過抗炎(如抑制IL-1β、TNF-α等)、抗氧化、抑制凋亡等發揮保護和修復胃黏膜作用[8-9]。但穴區局部的起效機制仍不明確。腧穴作為艾灸刺激的作用點，在施灸過程中可能發生某種改變，從而影響到艾灸效應的發揮。研究發現[10-12]，某些冠心病患者的部分腧穴(如勞宮、內關、神門等)在一定范圍內的紅外輻射光譜顯著低于正常人，一些潰瘍性結腸炎患者的沖陽穴在某些波長范圍內的輻射強度明顯低于正常人[13]。我們前期研究發現，急性胃黏膜損傷會導致腧穴能量代謝障礙，表現為線粒體結構異常，Na+/K+-ATP酶活性降低，出現細胞層面線粒體功能受損為核心的能量代謝低下。纖維狀蛋白是能量傳遞和信息傳遞的重要載體，膠原纖維與經絡現象中的能量傳輸有關，I型膠原蛋白可以接受紅外光譜的刺激，參與能量傳遞[14-16]。研究認為，艾灸可產生0.8～5.6 μm的紅外光譜，且峰譜多數集中在1.5～3.5 μm附近，與腧穴波譜相似從而可能引發共振[17-18]。由此推論，艾灸產生的紅外輻射作用于穴區局部，引起局部的能量代謝的變化，表現為線粒體Na+/K+-ATP酶活性增強，這一能量變化引起蛋白質分子比如I型膠原蛋白分子的酰胺鍵產生振動，使得生物能量得以沿蛋白質分子進行傳遞[15]，最終產生局部的靶器官修復效應。綜上所述，隔藥灸能夠改善急性胃黏膜損傷家兔“后三里”穴穴區線粒體形態、提高急性胃黏膜損傷家兔后三里穴穴區組織中I型膠原蛋白的表達，提示隔藥灸修復急性胃黏膜損傷與其提高腧穴局部組織的能量代謝有關，但其能量的具體傳輸機制還有待于進一步探討。

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(2015-05-11收稿 責任編輯：張文婷)

Effect of Herbs-Partitioned Moxibustion on The Point Area Mitochondria and Collagen Type I of Acute Gastric Mucosal Injury Rabbits

Zhou Zhigang1,2, Luo Weixu2, Zhang Xueqiang2, Qin Ken2, Dou Chuanzi1, Wu Huangan1

(1ShanghaiUniversityofTCM,Shanghai201203,China; 2JiangxiUniversityofTCM,Nanchang,Jiangxi330004,China)

Objective:To observe the effect of moxibustion on gastric mucosa injury index, the local structure of mitochondria and expression of type I collagen in acute gastric mucosal injury rabbits, and discuss the working mechanism of moxibustion on acute gastric mucosal injury from the perspective of gastric mucosal repair and energy metabolism of local acupoint. Methods: A group of New Zealand rabbits were randomly divided into normal group, model group, moxibustion group and western medicine group. As acute gastric mucosal injury model was successfully prepared, moxibustion group used ST36(Housanli) treatment, western medicine group used sucralfate gavage treatment. After the intervention, gastric mucosa and acupoint local tissue was reserved, using Guth method to observe index of gastric mucosal injury and transmission electron microscope to view local tissue mitochondrial morphology of ST36(Housanli). Also, immunohistochemistry was used to detect the expression of type I collagen. Results: Compared with the normal group, gastric mucosal injury index of rabbits in model group, western medicine group and herbs-partitioned moxibustion group were significantly increased (P<0.01). Cells in acupoint of model group appeared mitochondrial vacuolation, and expression of type I collagen was decreased (P<0.01). Besides, only a few mitochondria showed edema in moxibustion group and mitochondria decreased and mitochondrial cristae was not obvious in the western medicine group. Compared with the model group, gastric mucosal injury index decreased significantly (P<0.01), while the expression of type I collagen increased (P<0.01 orP<0.05) in moxibustion group and Western medicine group. Gastric mucosal injury index in moxibustion group was lower than that in western medicine group (P<0.01), thus type I collagen expression was higher than that in western medicine group, but the difference was not statistically significant (P>0.05). Conclusion: Herbs-partitioned moxibustion could improve mitochondrial morphology and increase the expression of collagen type I in acute gastric mucosal injury rabbits, which may be an effective approach to repair gastric mucosal injury.

Herbs-partitioned moxibustion; Acute gastric mucosal injury; Mitochondria; Collagen type I; Gastric mucosal protection

上海市教委預算內科研項目(編號：2013JW53)；國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)資助項目(編號：2009CB522900)

周志剛(1971—)，男，江西蓮花縣人，博士，副教授，研究方向：灸法作用的基本原理與應用規律研究

竇傳字(1984—)，男，山東青島人，博士，助理研究員，研究方向：針灸治療胃腸疾病，E-mail：dchuanzi@126.com；吳煥淦(1956—)，男，浙江仙居人，博士，教授，研究方向：灸法作用的基本原理與應用規律研究，E-mail：wuhuangan@126.com

R245;R573.4

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.11.034