丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳腺癌細胞株的作用及其機制研究

西安交通大學醫學院第二附屬醫院腫瘤科(西安710004)

惠文濤 馬小斌△ 昝 瑛 馬一楠

△通訊作者

丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳腺癌細胞株的作用及其機制研究

西安交通大學醫學院第二附屬醫院腫瘤科(西安710004)

惠文濤 馬小斌△昝 瑛 馬一楠

目的：研究丹參酮ⅡA磺酸鈉對雌激素受體(ER)、表皮生長因子受體-2(HER-2)表達不同的人乳腺癌細胞株(MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231)的作用，并探討其作用機制。方法：以0.025～0.8μg/ml不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉處理MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細胞，MTT法測定不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對三種乳腺癌細胞株細胞增殖的抑制作用，流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期。結果：丹參酮ⅡA磺酸鈉處理后，MCF-7細胞增殖活性降低，凋亡指數升高，細胞周期分布改變，G0/G1期細胞數增加，S期和G2/M期細胞數減少；SKBR-3和MDA-MB-231細胞增殖活性、細胞凋亡及細胞周期無明顯改變。結論：丹參酮ⅡA磺酸鈉對ER陽性乳腺癌細胞具有生長抑制作用,其作用機制可能與凋亡誘導、細胞周期阻滯有關；丹參酮ⅡA磺酸鈉對ER陰性、HER-2陽性和ER陰性、HER-2陰性乳腺癌細胞無明顯生長抑制作用。

丹參酮ⅡA是從中藥丹參中提取的有效脂溶性成分[1]，丹參酮ⅡA磺酸鈉是其溶于水的劑型。研究表明，丹參酮ⅡA對多種腫瘤細胞具有殺傷和促進凋亡作用[2-3]。有報道丹參酮ⅡA對ER陽性乳腺癌細胞具有生長抑制的作用[4],但其作用機制,及對ER、HER-2表達不同的乳腺癌細胞作用差異尚不清楚。本實驗通過觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉對MCF-7、SKBR-3和MDA-MB-231細胞株的增殖、細胞凋亡和細胞周期分布的影響，探討丹參酮ⅡA對人ER、HER-2表達不同的乳腺癌細胞的作用及可能作用機制。

材料和方法

1 主要材料和試劑 MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細胞株，購自西安交通大學第二附屬醫院中心實驗室細胞庫,DMEM高糖培養基(美國 Hyclone公司)，PBS粉劑(京中杉生物有限公司)，胎牛血清(美國 Hyclone公司)，胰酶粉劑(美國 Hyclone公司)，EDTA粉劑(美國 Hyclone公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國 Sigma公司)，二甲基亞砜DMSO(美國 Sigma公司),碘化丙啶(Propidiumiodide, PI) (美國 Sigma公司)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(珠海健康元生物醫藥公司)。丹參酮ⅡA磺酸鈉(上海第一生化藥業有限公司)，使用時用含血清的培養基配置至所需濃度，現用現配。

2 方 法

2.1 細胞培養和傳代：人乳腺癌細胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231用含10%滅活小牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養液，在37℃、50ml/L CO2、飽和濕度孵箱培養。當細胞80%～90%匯合時，用含有0.04%EDTA的胰酶消化，以1∶1傳代，48 h換液，2～3d再次傳代，細胞呈指數生長時進行分組實驗。

2.2 MTT檢測細胞增殖抑制率：選取對數生長期的MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細胞，經胰酶消化、臺盼藍染色后在血球計數板上計數，確保活細胞在97%以上。調整細胞濃度為每孔1×105個/ml(每孔100 μl)，加入96孔培養板內，置于37℃、5% CO2孵箱中培養。將細胞進行同步化處理，并分實驗組、培養基對照組、DMSO對照組，每組3個復孔。次日更換培養基，實驗組分別更換為含0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉的培養基，培養板放回孵箱培養72 h，取出培養板，每孔加入MTT (5mg/ml)20μl，繼續培養4 h。吸出上清液，加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，在平板搖床搖10 min，用酶標儀測490 nm 波長處每孔的吸光度(A值)。

細胞生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，實驗重復3次。

2.3 AnnexinV-FITC/PI雙標記染色檢測細胞凋亡：取處于對數生長期的細胞，常規消化，制成單細胞懸液，以1×105個/ml細胞濃度接種于6孔板中。次日起更換為含0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉的培養基，72h后離心收集細胞。按AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒提供的方法進行染色，取5×105個/ml細胞懸液1ml，離心后加入500μl的1×Banding Buffer，再依次加入5μl Annexin V-FITC，10μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育10min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。實驗重復3次。

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期：取處于對數生長期的細胞，常規消化，制成單細胞懸液，以1×105個/ml細胞濃度接種于6孔板中。次日起更換為含0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉的培養基，72h后離心收集細胞。取5×105個/ml細胞懸液2ml，離心后棄去上清液，PBS洗滌2次×10min，用遇冷的75%酒精固定，4℃過夜；離心棄去酒精，PBS洗滌2次×5min；加PI染液100μl，4℃避光染色30min；流式細胞儀檢測細胞周期分布。實驗重復3次。

2.5 統計學方法:采用SPSS 13.0統計學軟件，數據用均數±標準差描述，采用單樣本均數的t檢驗分析各組數據均值的大小，采用方差分析對各組數據進行比較分析，采用SNK-q檢驗進行各組數據兩兩之間的比較分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 MTT法測定丹參酮ⅡA磺酸鈉對細胞增殖的影響 MTT法測定不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉作用于乳腺癌MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細胞72h對細胞增殖的抑制作用，結果見圖1。

1.1 不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對MCF-7細胞抑瘤率差異無統計學意義(F=0.034，P>0.05)；不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對SKBR-3細胞抑瘤率差異無統計學意義(F=0.098，P>0.05)；不同濃度丹參酮ⅡA磺酸鈉對MDA-MB-231細胞抑瘤率差異無統計學意義(F=0.068，P>0.05)。

1.2 0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉對MCF-7細胞抑瘤率為0.1037±0.0287，明顯大于0(t=10.848，P<0.01)；0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉對SKBR-3細胞抑瘤率為0.0291±0.0727，與0相比差異無統計學意義(t=1.202，P>0.05)；0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉對SKBR-3細胞抑瘤率為0.0034±0.0524，與0相比差異無統計學意義(t=0.198，P>0.05)。

圖1 丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳腺癌細胞增值抑制作用

2 丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳腺癌細胞凋亡的影響 0.8μg/ml丹參酮ⅡA磺酸鈉處理72h后，MCF-7細胞實驗組凋亡率為5.16%，與對照組(1.33%)相比差異有統計學意義(P<0.05)；SKBR-3細胞實驗組凋亡率為2.64%，與對照組(2.51%)相比差異沒有統計學意義(P>0.05)；MDA-MB-231細胞實驗組凋亡率為3.98%，與對照組(3.84%)相比差異沒有統計學意義(P>0.05)，見圖2。

3 丹參酮ⅡA磺酸鈉對乳腺癌細胞周期的影響 0.8μg/ml丹參酮ⅡA處理MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231細胞72 h后,MCF-7細胞G0/G1期細胞數增加,S期和G2/M期細胞數減少，差異有統計學意義(P<0.05)；SKBR-3、MDA-MB-231細胞G0/G1期，S期和G2/M期細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

討 論

目前乳腺癌的治療是以手術為主，輔以化療、放療、內分泌治療、分子靶向治療等的綜合治療。并且ER、PR、HER-2表達不同的乳腺癌預后及對化療藥物的敏感性不同[5-6]。中藥作為中國的傳統醫藥，是乳腺癌治療的另一個手段，具有副作用少、容易耐受的特點，適合作為乳腺癌患者，尤其是不能耐受化療的晚期乳腺癌患者的輔助治療[7]。丹參酮ⅡA是從中藥丹參根部提取的脂溶性有效成分,既往研究表明丹參酮ⅡA對多種腫瘤細胞具有細胞毒作用和凋亡誘導作用,具有抑制人ER陽性乳腺癌細胞生長[8]，但其作用機制及對ER陰性和HER-2陽性的乳腺癌細胞的作用尚不清楚。

本研究用丹參酮ⅡA磺酸鈉處理ER、PR、HER-2表達不同的乳腺癌細胞(MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231)，檢測其抑制作用。結果表明，丹參酮ⅡA磺酸鈉對MCF-7細胞增殖有明顯的抑制作用，0.025～0.8μg/ml濃度的抑瘤率大小無明顯差異，丹參酮ⅡA磺酸鈉對KBR-3、MDA-MB-231的作用微弱，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉對ER陽性乳腺癌具有抑制作用；對ER陰性、HER-2陽性和ER陰性、HER-2陰性的乳腺癌無明顯抑制作用。丹參酮ⅡA磺酸鈉處理MCF-7細胞后,細胞凋亡率升高，G0/G1期細胞比例增加，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉對MCF-7細胞的抑制作用可能與誘導凋亡及細胞周期阻滯有關[9]。

劉永惠等[10]報道，經蛋白酶聯免疫法檢測發現，丹參酮能有效抑制突變型P53和mdm2的表達，證實了其在抑制腫瘤生產、轉移中具有重要作用。CyclinD1 為細胞周期G1/ S 期的調控點, 其過表達能縮短G1期, 促使細胞提前進入S 期, 引起細胞生長失控、轉化和癌變[10],丹參酮ⅡA磺酸鈉對人ER陽性乳腺癌細胞具有生長抑制作用,其作用機制可能與細胞周期阻滯、誘導凋亡有關。對ER陰性、HER-2陽性和ER陰性、HER-2陰性的乳腺癌無明顯抑制作用，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉可能通過雌激素受體發揮作用，而對雌激素受體陰性乳腺癌細胞未能發揮作用，本實驗僅是觀察到了這一現象，進一步的分子機制及其與細胞周期的關系需要進一步的實驗研究。

[1] 郝文慧，趙文文，陳修平.丹參酮類抗腫瘤作用與機制研究進展[J].中國藥理學通報,2014 ,30( 8) : 1041-1044.

[2] Chen J，Shi DY，Liu SL，etal． Tanshinone ⅡA induces growth inhibition and apoptosis in gastric cancer in vitro and in vivo[J]．Oncol Rep，2012，27( 2) : 523-8．

[3] Zhao P W，Niu J Z，Wang J F，etal． Research on the inhibitoryeffect tanshinone ⅡA on breast cancer cell proliferation[J]． Chin Pharmacol Bull， 2010，26( 7) : 903-6．

[4] Xu Changliang,Xi Tao, Anti-migration and anti-angiogenic effects of tanshiononenIIA on breast cancer cell MDA-MB-435[J].Journal of Crmaceutical University, 2009,40(6):565-570.

[5] 陳 曦，吳晶晶，張 妍，等.三陰性乳腺癌臨床病理特征及與藥物敏感度蛋白的相關性[J].腫瘤防治研究,2014,41(5)：439-442.

[6] 張曉麗,邵雪輝,楊翠軍,等.常用乳腺癌化療方案與ER、PR及C-erbB-2表達的相關性[J].江蘇醫藥,2012，37(4)：424-426.

[7] 孫 飛，潘迎英，包玉花,等.中藥湯劑聯合化療治療乳腺癌臨床療效系統評價[J].遼寧中醫藥大學學報，2014,16(7):156-159.

[8] 趙丕文,牛建昭,王繼峰,等.丹參酮ⅡA抗乳腺癌細胞增殖作用研究[J].中國藥理學通報，2010,26(7):903-906.

[9] 王愛紅，王明全，龐秋霞,等.番茄紅素對乳腺癌MDA-MB-231 細胞周期和增殖的影響[J].陜西醫學雜志，2008,37(11):1482-1484.

[10] 劉永惠，郭少賢，常 靖,等.丹參酮對血瘀證乳腺癌P53基因、mdm2基因表達的影響[J].陜西中醫，2011,32(12):1666-1667.

(收稿：2015-03-03)

Growth inhibition effect of tanshinoneⅡA on human breast cancer cell lines and its mechanism

Department of Oncology, The Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Hui Wentao Ma Xiaobin Zan Ying et al

Objective:To investigate the growth inhibition effect of tanshinoneⅡA on human breast cancer cell lines and its mechanism.Methods :MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231 cells were cultured with different concentration (0.025～0.8μmol/L) of tanshinoneⅡA in vitro. MTT assay was used for analyzing the growth inhibitory effect of tanshinoneⅡA in human breast cancer cell lines. The apoptosis rate and cell cycle distribution was detected by flow cytometric analysis. Results:TanshinoneⅡA could inhibit effectively MCF-7 cells . Flow cytometric analysis showed apoptosis ratio of MCF-7 rised, G0/G1 phase cell populations increase ,and S，G2/M phase cell populations decrease in 0.8μmol/L concentrations of tanshinoneⅡA group after 72h．TanshinoneⅡA could not inhibit effectively SKBR-3、MDA-MB-231 cells．Conclusions:TanshinoneⅡA could inhibit effectively human breast cancer cell with estrogen receptor positive. The mechanism for the effect may be associated with induction of apoptosis and cell cycle arrest. TanshinoneⅡA can not inhibit Human Breast Cancer Cell with Estrogen Receptor Negative.

TanshinoneⅡA Breast neoplasms/immunology Receptors,Estrogen Receptors,Epidermal growth factor

丹參酮IIA 乳腺腫瘤/免疫學 受體，雌激素 受體，表皮生長因子

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.004