加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織miRNA-146a表達的影響*

晁旭董昌虎李宏任清維鄭旭銳王國全

陜西中醫學院(咸陽 712046)

加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織miRNA-146a表達的影響*

晁 旭△董昌虎△李 宏△任清維▲鄭旭銳王國全

陜西中醫學院(咸陽 712046)

目的：檢測加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織的病理和miRNA-146a表達的影響。方法：加味四逆散治療二甲基亞硝胺( DMN)誘導的肝纖維化大鼠后，通過HE染色觀察治療前后肝組織病理變化，并通過RT-PCR技術檢測miRNA-146a的表達。結果：與模型組比較，加味四逆散治療組大鼠肝組織匯管區可見輕度炎癥，纖維結締組織增生程度較治療前減輕，有顯著性差異(P≤0.05)。治療后的大鼠肝組織中miRNA- 146a 的表達明顯升高。結論：加味四逆散科通過調節miRNA-146a的表達實現對肝纖維化的逆轉。

MicroRNA (miRNA)是一類長度為18-26nt非編碼RNA，它可與靶基因3，端非編碼區的特異序列結合，對靶基因進行轉錄后水平負調控，進而影響細胞的多種生理和病理過程[1,2]。研究表明，miRNA這一轉錄后水平的調控因子可通過調控細胞增殖、凋亡、脂代謝/脂肪酸代謝等一系列相關通路在許多肝臟疾病的發生發展過程中發揮重要作用[3]。有關miRNA在肝臟疾病的發生和治療中的作用已經成為當前研究的熱點。

miRNA-146a基因是位于人體5號染色體LOC285628基因的第二個外顯子區，它作為免疫和炎癥反應的負調控因子，有助于自體免疫疾病的恢復，如系統性紅斑狼瘡，類風濕關節炎等[4-5]。miRNA-146a 可以通過激活Smad4調控TGF-β1誘導的肝星狀細胞，進而導致肝纖維化[6]。

加味四逆散是臨床上用于治療慢性病毒性肝炎的中藥復方，具有良好的防治肝纖維化作用[7-9]。但是，加味四逆散對肝纖維化大鼠肝組織中miR-146a表達的影響及其生理意義尚未見文獻報道。本研究以二甲基亞硝胺( DMN)誘導的肝纖維化大鼠為材料，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應技術，檢測加味四逆散治療前后肝組織中miRNA-146a的表達，探討加味四逆散對miR-146a表達的影響。

1 材料與方法 1.1 藥品及試劑 加味四逆散由黃芪、丹參、姜黃、桃仁、柴胡、甘草、白芍、枳殼八種中藥材組成，組方中各種藥物的質量比為10∶10∶5∶2.5∶1. 5∶1∶5∶2.5。所有藥物均購自陜西中醫學院附屬醫院中藥房，并經本院中藥教研室鑒定。所有藥物稱量好后，加注射用水400 mL，煎煮20 min后，取濾液200 mL。再按上述操作重復煎煮1次。然后將兩次煎煮的濾液混合，水浴蒸發至濃度為3.5 g /mL。秋水仙堿、TRIzol Regent購自美國Invitrogen公司、qRT-PCR 逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒購自大連寶生物工程有限公司、二甲基亞硝胺購自Sigma-Aldrich(中國)公司、引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 肝纖維化大鼠制備 60只清潔級SD大鼠(體重為180 ± 20 g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心)適應性飼養1周后，隨機分為6組，每組10只。分別為空白對照組、模型對照組、加味四逆散大劑量組、加味四逆散中劑量組、加味四逆散小劑量組和秋水仙堿組。除空白對照組外，其余各組動物均以10 mL·kg-1體重的劑量灌胃DMN (5 g·L-1)，每日1次，每周連續3d，連續灌服4周。

1.3 給 藥 空白對照組和模型對照組均以4 mL·kg-1體重的劑量進行生理鹽水灌胃； 秋水仙堿組以0.01 mg·kg-1體重的劑量進行灌胃給藥；加味四逆散小劑量組、中劑量組和大劑量組分別以5 mL·kg-1、10 mL·kg-1和15 mL·kg-1體重的劑量灌胃加味四逆散煎煮液。以上各組用藥均1次/d，連續給藥30 d。

1.4 病理標本制作 給藥結束后，處死動物，取部分新鮮的肝組織用生理鹽水沖洗后，10%的甲醛固定，然后進行石蠟包埋，最后進行HE染色。按照病理組織學分級標準[10]分析治療前后肝組織纖維化程度。

1.5 miRNA-146a表達分析 取各組實驗動物新鮮肝組織，用TRIzol 試劑提取總RNA，經逆轉錄反應得到cDNA。將逆轉錄得到的cDNA分別按1、10、100 和1 000的倍數稀釋，然后在ABI 7300 Real-timePCR 儀( Applied Biosystems) 進行PCR。miRNA-146a引物為5'-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3'，下游引物為5'-ATCTACTCTCTCCAGGTCCTCA-3')，內參基因U6 small nuclear RNA( snRNA)的上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')。反應完后，計算各組樣品中miRNA-146a 和U6snRNA 的平均Ct值，然后用U6 snRNA對模型組和治療組樣品中miRNA-146a的Ct 值進行校正，得出個實驗組的ΔCt，再進行歸一化處理，得到ΔΔCt，最后用相對定量法( RQ = 2-ΔΔCt) 計算miRNA-146a 基因表達的差異。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0 軟件進行數據處理，組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果 2.1 大鼠癥狀表現 給藥期間，空白組大鼠皮毛光滑，大便及飲食飲水量正常。模型對照組動物皮毛凌亂無光澤，飲食飲水量明顯減少、反應遲鈍、糞便稀薄。秋水仙堿治療組動物治療3周后，進食、攝水量正常，大便正常，精神狀態好轉。加味四逆散小劑量治療組與空白對照組動物相比較，生活狀態無明顯區別。而加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組動物3周后，進食、攝水量和大便趨于正常，生活狀態比治療前顯著改善。

2.2 組織病理學分析結果 HE染色結果顯示，模型組動物肝組織匯管區及小葉內有中度炎性細胞浸潤；大量膠原沉積于匯管區，呈較寬的條索狀纖維深入肝小葉。加味四逆散小劑量治療組與模型組動物肝組織結構無顯著差異。而與模型組比較，秋水仙堿治療組、加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組大鼠僅在匯管區可見輕度炎癥，纖維結締組織增生程度較治療前明顯減輕。該結果證實了加味四逆散組對肝纖維化良好的治療作用。

表1 各組大鼠肝臟組織纖維化分級

組 別n肝纖維化分級-±+空白對照組模型對照組秋水仙堿組加味四逆散小劑量組加味四逆散中劑量組加味四逆散大劑量組1010101010101003022003134022132041411

2.3 肝組織中miRNA-146a的表達 肝組織中miRNA-146a的表達結果顯示，相對于空白對照組，二甲基亞硝胺( DMN)誘導的肝纖維化大鼠肝組織中miRNA- 146a 的表達顯著降低(P< 0.05)。秋水仙堿治療組、加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組大鼠肝組織中miRNA- 146a 的表達明顯升高，與空白對照組無統計學差異,見圖1。

圖1 各實驗組大鼠肝臟組織中miRNA-146a的表達

3 討 論 近年來，隨著遺傳學及肝纖維化機制研究的深入，microRNA(miRNA)在肝纖維化進程中的作用逐漸被重視。Microarry分析結果顯示，相對于靜息狀態的肝星狀細胞(HSCs)，被TGF-βl激活的HSCs中miR-146a 的表達顯著地下調[11]。進一步研究顯示，miRNA-146a以Smad4為作用靶點，通過TGF-βl/Smads信號通路抑制TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖；其機制是miR-146a可以Smad4 mRNA的3'端的非編碼區結合，從而使Smad4基因翻譯失活[12-13]。

加味四逆散是在臨床上用于治療肝纖維化療效確切的中藥方劑，具有防止肝纖維化形成、阻斷肝纖化發展、逆轉肝纖維化進程等顯著效果。本研究結果顯示，相對于空白對照組，二甲基亞硝胺( DMN)誘導的肝纖維化大鼠肝組織中miRNA-146a 的表達顯著降低(P<0.05)；而秋水仙堿治療組、加味四逆散中劑量治療組和大劑量治療組大鼠肝組織中miRNA- 146a的表達明顯升高。該結果提示我們，加味四逆散通過調節miRNA-146a的表達，實現對肝纖維化的逆轉。但其具體機制，還需進一步研究。

[1] Lytle, J.R., T.A. Yario and J.A. Steitz, Target mRNAs are repressed as efficiently by microRNA-binding sites in the 5' UTR as in the 3' UTR[J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 2007, 104(23): 9667-9672.

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[3] Haybaeck J, Zeller N and Heikenwalder M.The parallel universe: micrograms and their role in chronic hepatitis, liver tissue damage and hepato carcinogenesis [J]. Swiss Medical Weekly, 2011, 141:13287-13292.

[4] Cameron JE，Yin Q，Fewell C，et al.Epstein- Barr virus latent membrane protein 1 induces cellular MicroRNA miR-146a，a modulator of lymphocyte signaling pathways[J].Virol,2008,82 ( 4 ) :1946-1958．

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(收稿2014-06-11；修回2014-07-25)

Expression of miRNA-146a in liver tissue of hepatic fibrosis in rats treated with Jiawei Sini powder

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Chao XuDong ChanghuLi Honget al

Objective：To study the significance of pathological changes and miRNA-146a expression in liver tissue of Hepatic Fibrosis in Rats treated with Jiawei Sini powder. Methods ：The pathology changes were observed by HE staining and expressions of miRNA-146a in liver tissue of hepatic fibrosis in rats treated with Jiawei Sini powder were detected by SYBR Green quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ( qRT-PCR) analysis．Results： There were only mild inflammation in portal area and ease of fibrous connective and the expression of the miRNA-146a significantly increased in liver tissue of hepatic fibrosis rats treated with Jiawei Sini powder.Conclusion ：Jiawei Sini powder could regulate the expression of miRNA-146a to inhibit hepatic fibrosis.

Jiawei Sini powder Hepatic fibrosis miRNA-146a expression Animal,experiment Rats

*咸陽市科學技術研究計劃項目(2014k04-02)

加味四逆散 肝纖維化 miRNA-146a 表達 動物，實驗 大鼠

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.057

△陜西中醫學院第二附屬醫院(咸陽 712000)

▲陜西省周至縣人民醫院(周至710400)