地黃飲子含藥血清對海馬腦片SDF-1的影響*

王 倩 范文濤 賀又舜

湖南中醫藥大學(長沙 410208)

地黃飲子含藥血清對海馬腦片SDF-1的影響*

王 倩△范文濤△賀又舜

湖南中醫藥大學(長沙 410208)

目的：探討地黃飲子對大鼠海馬腦片SDF-1蛋白的影響。方法：SD大鼠18只，用乙醚麻醉大鼠，分離海馬組織，培養2周后，分為對照組(HOTC組)和低氧缺糖組(OGD組)。采用地黃飲子含藥血清培養海馬腦片，觀察地黃飲子含藥血清對海馬腦片SDF-1的影響。結果：研究發現用地黃飲子含藥血清培養大鼠腦片，能明顯提高缺血、缺氧組腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量，與對照組比較具有顯著差異，說明地黃飲子能促進缺血區SDF-1的表達，進一步促進低氧低糖區腦組織神經再生能力。結論：地黃飲子含藥血清能有效提高缺血缺氧區腦片SDF-1含量，進一步改善腦組織缺血缺氧能力，通過SDF-1/CXCR4信號通路促進腦組織神經再生能力。

在正常情況下的神經干細胞處在休眠狀態，只有在一定的信號條件下才可以被激活。腦缺血時,海馬、側腦室室管膜下區以及腦皮層可增殖的神經干細胞被炎癥刺激激活，進一步遷移到缺血損傷區，分化成神經元細胞和膠質細胞，創建新的神經連接。新生的神經細胞可以替代損傷的神經元，修復神經功能缺損。這表明,內源性神經干細胞具有修復缺血性腦損傷的能力。因為通過激活內源性神經干細胞所獲得的神經干細胞有限，數量較少，同時調控神經干細胞遷移、分化的激活因子不足，最終導致自身不能修復神經功能缺損。本文研究地黃飲子通過調控SDF-1蛋白進一步促神經再生的作用機制。

1 實驗材料 1.1 動 物 新生6～9 d健康SD大鼠18只，清潔級，雌雄不拘，購自西安交通大學醫學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK2012-003。

1.2 藥 物 中藥地黃飲子以《黃帝素問·宣明論方》所載地黃飲子藥味和比例配制：熟地黃、白茯苓、菖蒲各12g，巴戟天、 山茱萸、石斛、肉蓯蓉、麥門冬、炮附子各15g(先煎)， 官桂、 五味子、遠志各10g。

根據2010 年版《中國藥典》選擇中藥材飲片：藥材飲片購買于陜西省西安市中藥飲片有限責任公司，飲片經陜西中醫學院藥學院中藥鑒定學教研室鑒定為道地藥材。按組方配伍比例精確稱取，加入12倍重量的自來水，先泡40min，再大火煎煮10min，小火煎煮30min，留取藥液；再次加入12倍重量的自來水，再大火煎煮10min，小火煎煮30min，留取藥液；然后將2次所取藥液混合，裝入容量瓶成為地黃飲子煎劑。在旋轉蒸發儀蒸發濃縮后，定容裝入玻璃凍干瓶冷凝干燥，干燥條件：-55℃，真空度：<10 Pa，時間：24 h。計算凍干粉獲得率，最后裝入密閉玻璃容器中密封保存。

1.3 主要試劑及儀器 MEM 培養基、馬血清、噻唑藍(MTT)、 抗膠質纖維酸性蛋白抗體、焦油紫均購于、兔抗SDF-1α、CXCR4多克隆抗體、生物素化二抗、辣根過氧化酶標記、膜插件、 體視顯微鏡、振動切片機、電位記錄系統、顯微鏡、 細胞培養箱。

2 實驗方法 2.1 地黃飲子含藥血清制備 采用大腦中動脈線拴法復制腦缺血模型。造模成功后灌服地黃飲子藥液每次2mL，劑量換算方法按照體表面積相當于正常成年人70Kg體重劑量的3倍，換算為大鼠的用藥劑量約為每公斤體重灌服生藥量14.5g。治療第7天給藥后斷頭處死動物，收集大鼠的血液，離心分離血清，放入溫度為56℃水浴中滅活30min，采用0.22μm濾器進行過濾，分裝并放置于-20℃的冰箱中備用。

2.2 海馬腦片培養 用乙醚麻醉大鼠，至于無菌環境，斷頭取出腦組織，放入含糖濃度為7.5 g/L的HBSS溶液中，溫度保持在4℃，分離出海馬組織。放在表面鋪有3%瓊脂的活組織切片機上，采用冠狀面切開腦組織，切成厚度約400μm的腦片。再將腦片放入6孔培養板的微孔濾膜上，培養板浸泡在培養液中。每個培養板含有6孔，每孔放置腦片6張，培養液含有5%CO2，溫度為37℃。將培養板放入平衡濕度的標準培養箱進行培養，隔日更換培養液，培養時間為2周。

2.3 分 組 培養分組：培養2周后，分為對照組(HOTC組)和低氧缺糖組(OGD組)。采用的培養液成分:25%HBSS、50%MEM、23%馬血清、0.75%葡萄糖、0.5%谷氨酰胺、2%雙抗。

2.4 地黃飲子含藥血清海馬腦片培養 海馬腦片培養2周后，在培養板各腦片培養液中加入0.1 mmol/L PI 90μL，在將培養板放置于溫度37℃、5%CO2、平衡濕度的標準培養箱內1 h。然后在倒置顯微鏡下觀察并挑選無特異性，PI熒光顯色較好腦片。經過篩選的腦片，對照組(HOTC組)加入正常培養液，培養條件為溫度37℃，并將腦片放置于含有5%CO2、平衡濕度的標準培養箱內進行培養。低氧缺糖組(OGD組)腦片加入無糖平衡鹽溶液(pH 7.4)做為培養液，培養條件為溫度37℃，并將腦片放置于含有5%CO2、1%O2的缺氧培養箱內進行培養。兩組腦片均放置1h，之后兩組均加入地黃飲子含藥血清，放置于正常培養箱中進行培養，培養時間為24h。最后兩組均加入PI，放置于普通培養箱中培養1h，用熒光倒置顯微鏡觀察，并拍照記錄。

2.5 組織切片制備 對照組(HOTC組)和低氧缺糖組(OGD組)腦片在普通培養箱中恢復培養24h后，分別用4%多聚甲醛固定、浸糖，再用冰凍切片機從冠狀面切片，切片厚度約20μm，再進行免疫組化染色備用。

2.6 免疫組化染色(ABC法) 腦切片采用0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。再用1% H2O2在溫室孵育30min，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。加入10%羊血清封閉1 h，不洗滌。分2次加入CXCR4兔抗多克隆抗體(1∶500)和兔抗SDF-1α多克隆抗體(1∶500)。陰性組腦片采用0.01mol/L PBS代替一抗，在溫度4℃下孵育48 h，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。再加入生物素化羊抗兔IgG(1∶200)，在溫度4℃下孵育12h，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素復合物(1∶200)，在溫度4℃下孵育12h，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。采用DAB/H2O2顯色5～10min，電鏡下檢測顯色的程度，用自來水反復沖洗10次以終止。最后采用乙醇梯度脫水，封蓋玻片以鏡下觀察。

2.7 Western blot檢測 實驗中取兩組腦片，分別是HOTC組、OGD組，兩組腦片按照每100mg的腦片分別加入1ml的勻漿液并充分攪拌勻漿，在溫度4℃離心機以12 000轉/min，離心10min，取上清液并進行分裝，存入-80℃的冰箱中備用。按Lowry et al的方法，采用小牛血清蛋白做為標準參考蛋白，進一步測定蛋白含量。再按照Gu et al方法，取等量的蛋白做為樣品待檢。用經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳后轉移至NC膜上，在經過5%脫脂奶粉封閉約1h，加入一抗(兔抗SDF-1抗體，兔抗CXCR4抗體)，在溫度4℃下放置24h。用洗滌緩沖液洗膜，然后添加熒光素和生物素標記的兩種抗體，在溫度為37℃溫孵1h，2min后洗膜。在采用電鏡觀察，并應用圖像分析系統記錄分析結果。

2.8 圖像及數據的統計處理 實驗獲得的免疫組化切片均在電鏡下采用圖像成像及分析系統進行成像及分析。數據采用表示，用SPSS 16.0軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結果與分析 3.1 采用Westernblot方法檢測HOTC組、OGD組大鼠海馬腦片SDF-1/CXCR4的變化 各組大鼠腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量測定，地黃飲子含藥血清培養大鼠腦片，能明顯提高缺血、缺氧組腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量，與對照組相比差異有顯著性意義的(P<0.05)。

組 別SDF?1CXCR4OGD組3．56±0．38△0．87±0．52△HOTC組1．82±1．210．36±1．03

注：與模型組比較△P<0.05

3.2 Western blot檢測大鼠腦片海馬區SDF-1

圖1 OGD組腦片海馬區SDF表達，OGD組海馬區SDF升高，陽性細胞數量增多。

圖2 HOTC組腦片海馬區SDF表達，HOTC組海馬區SDF升高不明顯，陽性細胞數量無明顯變化。

4 討 論 最新研究發現，SDF-1可以調節神經元信息傳遞。SDF-1mRNA和神經元CXCR4共同分布在腦組織相同部位，SDF-1具有神經調節功能。研究發現在局灶性腦缺血的大腦皮層中，SDF-1含量在腦缺血前2日含量持續升高[1]。研究表明，SDF-1可促進神經干細胞增殖、粘附、遷移和歸巢。在缺血性腦卒中大鼠實驗中，采用免疫組化方法觀察到第一個月和第四個月腦缺血邊緣SDF-1的表達水平顯著高于對側腦SDF-1對應的部分。對內源性神經干細胞起到誘導遷移并分化為神經細胞的作用[2]。腦缺血后炎癥因子刺激，引起海馬區及大腦皮層神經干細胞增殖，促進神經干細胞遷移，同時受神經生長因子及抑制因子的影響，促進損傷區對遷移中的神經干細胞捕獲，在損傷區域分化成神經元，建立神經神經連接，修復神經損傷[3]。實驗研究表明， SDF-1能夠促進神經損傷區刺激神經干細胞增殖，進一步促進神經干細胞遷移。同時，損傷區的細胞生長因子可以進一步促進缺血區對神經干細胞的捕獲，促進神經干細胞分化成神經元，修復神經損傷[4]。

SDF-1蛋白的受體是CXCR4，CXCR4具有7個跨膜結構，是一種G蛋白偶聯受體，通常存在于細胞膜的表面，部分也存在于細胞胞漿中。SDF-1及其受體CXCR4廣泛存在于人體多種細胞及組織中，主要存在于腦、心臟、肺臟、脾臟、肝臟。在中樞神經系統、循環系統及免疫系統中發揮重要的作用[5]。近年來的研究證實，SDF-1/CXCR4信號通路在神經干細胞遷移及歸巢、介導炎癥反應和神經再生等方面發揮著重要作用。研究發現，在人類中樞神經系統存在神經干細胞，神經干細胞具有增殖分化潛能，能分化為神經元及神經膠質細胞[6]。在正常情況下，他們在休息狀態，只有在一定的信號可以激活刺激。腦缺血時,海馬、大腦皮層等區域的神經干細胞開始增殖，進一步遷移，分化為神經元，建立新的神經連接，替代損傷區神經，促進缺血區神經修復[7]。這表明,內源性神經干細胞具有修復缺血性腦損傷的能力。然而，因為通過激活干細胞數量上的缺乏，導致腦缺血后內源性神經干細胞數量不足，同時調節新生神經元遷移、分化的促進因子分泌不足，最終導致自身修身神經損傷效果不佳。最近發現，SDF-1可調節神經細胞突觸傳遞。SDF-1與其受體分布在相同的腦區，SDF-1具有神經調節功能，可通過SDF-1/CXCR4信號通路進一步調控神經干細胞遷移[8]。本研究發現用地黃飲子含藥血清培養大鼠腦片，能明顯提高缺血、缺氧組腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量，與對照組比較具有顯著差異，說明地黃飲子能促進缺血區SDF-1的表達，進一步促進低氧低糖區腦組織神經再生能力。地黃飲子含藥血清能有效提高缺血缺氧區腦片SDF-1含量，進一步改善腦組織缺血缺氧能力，通過SDF-1/CXCR4信號通路促進腦組織神經再生能力。

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(收稿2014-10-11；修回2014-11-08)

Effect of Dihuang Yinzi protein on hippocampal slices of SDF-1 in rats

Hunan University of Chinese Medicine(Changsha 410208)

Wang Qian Fan Wentao He Youshun

Objective：To study Dihuang Yinzi protein in rat hippocampal slices of SDF-1. Methods：18 SD rats, rats with ether anesthesia, separation of hippocampus, training 2 weeks later, divided into the control group (group HOTC) and low oxygen lack of sugar group (OGD group). Using Dihuang Yinzi drug-containing serum cultured hippocampal slices, observation of Dihuang Yinzi drug-containing serum affect hippocampal slices of SDF-1. Results：The study found that with Dihuang Yinzi drug-containing serum training rats, can significantly improve the ischemia and hypoxia of brain slice of SDF-1 and CXCR4 protein content, compared with the control group with significant difference, Dihuang Yinzi can promote the expression of ischemia area SDF-1, to further promote the low oxygen sugar area brain nerve regeneration ability. Conclusion ：DiHuang YinZi medicated serum can effectively improve the ischemia anoxic zone slices SDF-1 content and further improve the cerebral ischemic anoxia ability, through the SDF-1/CXCR4 signaling pathway to promote brain nerve regeneration.

@Dihuang Yinzi Animal,experiment Rats

*陜西省科技廳資助項目(2012k19-05-04)

@地黃飲子 動物，實驗 大鼠

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.058

△陜西中醫學院(咸陽 712046)