PIK3R1 對多發性骨髓瘤細胞侵襲轉移的影響及其機制初探*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院血液科(西安 710061)

吳 迪 劉亞林 王夢昌▲

PIK3R1 對多發性骨髓瘤細胞侵襲轉移的影響及其機制初探*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院血液科(西安 710061)

吳 迪 劉亞林 王夢昌▲

目的：觀察應用RNA干擾(RNAi)技術敲低PIK3R1表達后在體外對人類多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226細胞侵襲的抑制作用。方法：將重組質粒表達載體pGenesil-1.1-PIK3R1轉染至RPMI8226細胞。Realtime PCR和Western blot分別檢測轉染前后目的基因mRNA和蛋白的表達水平,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞外基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的濃度變化。Transwell實驗評價腫瘤細胞侵襲能力的變化。結果：pGenesil-1.1-PIK3R1可以有效抑制PIK3R1 mRNA及蛋白的表達,MMP-2、MMP-9表達下調,基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-2表達上調，ELISA證實細胞外MM9-2、MMP-9濃度在治療組明顯減低。Tramwell穿過細胞數：對照組(115.5±3.9)和無義序列組(112.8±6.0), pGenesil-1.1-PIK3R1轉染組(73.7±4.0)。結論：靶向PIK3RI的RNAi技術可以序列特異性地抑制PI3KR1表達,在體外明顯抑制RPMI8226細胞的侵襲能力。

多發性骨髓瘤(MM)是發生于B細胞終末階段漿細胞的惡性血液系統腫瘤,至今仍不可治愈。這主要與MM患者髓外浸潤的發生密切相關。MM患者的髓外浸潤事件常常與骨髓瘤細胞增強的侵襲活性、復雜的細胞遺傳學異常伴隨發生。基因的異常被認為是多發性骨髓瘤疾病致病的重要因素。然而，目前使骨髓瘤細胞具有增強的侵襲活性的分子機制尚不明確。研究發現PI3K/AKT信號轉導通路與惡性腫瘤侵襲轉移的關系密切[1-2],PIK3R1(phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1, p85 alpha)基因負責編碼磷脂酰肌醇3-激酶(Phisphatidylinositol 3-kinase, PI3K)中85kD大小的調節亞基—p85α，p85α是PI3K家族中表達量最多的調節亞基,各種相關信號分子都需要與p85亞基結合后,才能激活PI3K,進而通過多種信號傳導通路影響細胞生長、分化、黏附及細胞周期進程，促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移,并抑制腫瘤細胞凋亡[3-4]。目前，對于PIK3R1是否能夠影響MM細胞的侵襲活性，PIK3R1以及PI3K信號轉導通路在MM患者中的作用知之甚少。因此,本文應用質粒載體介導的PIK3R1 siRNA轉染人類多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226和純化的原代多發性骨髓瘤細胞,使PIK3R1基因下調,從而觀察PIK3R1對骨髓瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期進程、侵襲活性的影響,并檢測PI3K/AKT信號通路在MM細胞中的表達,以了解其可能的作用機制,為基因治療多發性骨髓瘤提供理論依據。

材料與方法

1 材 料 人類多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226 (本實驗室保存)。pGenesil-1.1 購自Genesil生物技術公司。RPMI1640購自美國生命技術公司(Gibco/BRL)，多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。Western blot所用試劑購自美國Sigma公司，逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。引物序列：人PIK3R1引物上游5'-AGCATTGGGACCTCACATTACACA-3', 下游引物5'- ACTGGAAACACAGTCCATGCACATA-3'，內參照上游引物為5'- TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，下游引物5'-CTCCGACCTTCACCTTCC-3'。Transwell購自Costar公司。

2 方 法 ①質粒載體pGenesil-1.1-PIK3R1構建：(干擾序列：GTAAAGCATTGTGTCATA,位于編碼區2040-2058)。根據Genebank報道的PIK3R1的mRNA序列(NM_181523.1),參考siRNA的設計原則[5],利用Ambion公司siRNA在線設計軟件從PIK3R1核心蛋白基因起始密碼子下游尋找符合設計特征的靶序列。經BLAST Search檢索確認與PIK3R1以外的人類已知基因序列無同源性。此外設計合成了針對與人PIK3R1序列無關的序列作為陰性對照,目標基因序列為5'-GACTTCATAAGGCGCATGC -3',以及針對管家基因GAPDH的RNAi序列作為陽性對照, 目標基因序列為5'-GTGGATATTGTTGCCATCA -3'。針對靶序列分別合成1對寡核苷酸鏈順序依次為CACC、19 nt正義序列、9 nt loop插入序列(5'-TTCAAGACG-3')、19 nt反義序列、轉錄終止信號(5個T)、SacI酶切位點。經質粒酶切、連接及鑒定，構建干擾質粒載體pGenesil-1.1-PIK3R1。②細胞培養：培養RPMI8226細胞于10 cm細胞培養皿中，采用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養液，培養條件為37℃，5%CO2孵箱濕潤培養。③實驗分組與轉染：實驗分組：空白對照組(contro1)、無義序列組(HK)、重組質粒pGenesil-1.1-PIK3R1 (P+P)。轉染：棄培養液，加入無血清培養液7～8ml，加完全培養液繼續培養48～72h。重組質粒中有熒光蛋白真核表達框，因此可以通過熒光計算轉染效率。計算轉染率>95%可以進行后續實驗。④Real-time PCR：轉染后48h，提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA。Real-time PCR擴增體系50μl：SYBR Green 25μl，ROX 1μl，ddH2O 20μl，cDNA50ng，上游引物20pmol，下游引物20pmol。反應條件：StageI：95 ℃ 10 s(循環數1)，Stage2：95℃ 5s， 60℃ 31s(循環數40)。另取不同的模板濃度(0.2、2、20、200ng)進行 PCR 反應，制定各基因的標準曲線，并測定各樣本 PCR 反應液的熔解曲線，每樣本做 3 個復管。用Bio-Rad iQ5自帶軟件求出各樣本的CT值，2 -△△CT方法計算各基因的相對表達量。⑤Western blot：轉染48～72h收集細胞，PBS沖洗2次, 加RIPA細胞裂解液裂解，超聲破碎，細胞蛋白樣品于100℃水浴5 min。將各組細胞樣品的蛋白濃度調整一致后，各取20μl上樣進行SDS-PAGE，電泳完畢后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，PVDF膜以含2%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉2 h，加PIK3R1多克隆抗體(工作濃度1∶200)， 4℃孵育過夜，山羊抗小鼠二抗(1∶2000)室溫孵育2h, ECL試劑于暗室自顯影，X線膠片曝光，于自動電泳凝膠成像分析系統下成像并分析結果。⑥酶聯免疫吸附試驗(ELISA)：常規轉染，繼續培養48h后各提取培養液1ml，參照ELISA試劑盒說明，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測轉染前后細胞培養上清中MMP-2、MMP-9濃度。分別將抗人MMP-2/MMP-9單抗包被于酶標板上，標準品與樣品中的MMP-2/MMP-9與單抗結合，加人生物素化的抗人MMP-2 /MMP-9，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入酶底物OPD，出現黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測OD值,MMP-2/MMP-9濃度與OD值成正比，通過繪制標準曲線求出標本中MMP-2/MMP-9濃度。⑦Transwell實驗：在Transwell上室的聚碳酸酯膜(直徑6.5mm)上先加入1:2 (matrigel:RPMI1640)的Matrigel 60～80μl，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠。Transwell下室中加入10%FBS的完全培養基600μl；待檢細胞無血清培養基制成單細胞懸液(設復孔3個)；在上室孔中加入細胞l×105個/孔，細胞懸液體積150μl，常規培養24h拭去上面的Matrigel膠，蘇木素染色，200倍顯微鏡下計數背面穿過的腫瘤細胞數，各選8個視野，計算平均值。

結 果

1 質粒構建結果 質粒pGenesil-1.1 的多克隆位點(MCS)如下：-MluI-hU6 promoter-Insert DNA-SacI-。送轉化菌液去測序，經測序證實與設計的siRNA轉錄模板序列相同(見圖1)。

2 Real-time PCR檢測轉染前后目的基因mRNA的表達(ΔCt值) PIK3R1(對照組11.993±0.163、HK組12.077±0.148、P+P組12.961±0.169)，經分析P+P組與對照組和HK組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖1 質粒pGenesil-1.1模式圖及重組質粒pGenesil-1.1-PIK3R1測序結果

3 Western blot檢測轉染前后目的基因及其相關因子的蛋白表達情況 見圖2。HK組的目的蛋白條帶灰度值為對照組的.PIK3R1(112.94±3.74)%；P+P組的目的蛋白條帶灰度值為對照組的PIK3R1(29.06±16.17)%，表明轉染后p85α的蛋白表達明顯減低。P+P組的其他相關因子分別為對照組的MMP-2(28.38±7.37)%、MMP-9(42.26±9.46)%、TIMP-2(223.23±18.04)%。

圖2 p85α蛋白印跡結果

4 ELISA 根據標準曲線計算出各組培養液MMP-2濃度為對照組：(129.72±6.33)μg/L，HK組：(127.68±3.68) μg/L，轉染組：(69.32±3.38)0μg/L；MMP-9濃度為對照組：(132.77±24.50) μg/L，HK轉染組：(128.32±17.21) μg/L，A+P轉染組：(39.94±6.07) μg/L。與對照組和HK組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

5 Transwell實驗 結果顯示對照組、HK組穿過細胞數分別為(115.5±3.9)和(112.8±6.0)，而P+P組為73.7±4.0)。經分析與對照組和HK組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

討 論

MM重要特征之一為骨髓中多部位受惡性漿細胞累及，并浸潤其他器官,臨床上，約有5%的MM患者進展為漿細胞白血病。由于現有的治療手段使MM患者總的生存時間延長，因此臨床上觀察到MM患者髓外浸潤的發生率升高[6]。雖然先進的治療手段不斷出現，但MM患者的預后仍然很差。眾所周知，腫瘤細胞的侵襲能力不僅是惡性腫瘤的重要標志，還與較差的臨床預后緊密相關。骨髓瘤細胞遷移是非常有害的病理過程，使細胞具有侵襲和播散能力。然而目前調節骨髓瘤細胞遷移至骨髓并侵襲其他部位的機制卻知之甚少。如果這些機制能夠被闡明，對于尋找新的治療方法將有很大的幫助[7-8]。

PI3K是生長因子超家族信號傳導過程中的重要分子，可被多種細胞因子和理化因素激活，調節多種細胞功能，如凋亡、增殖、代謝、生長轉化、膜轉運、分泌和趨化等，并在炎癥、腫瘤、代謝和心血管疾病的發病機制中起重要作用[3-4]。PI3K由110kD大小的催化亞基和85kD、55 kD或50 kD大小的調節亞基構成，能夠磷酸化磷脂酰肌醇上的肌醇環。PIK3R1基因負責編碼調節亞基p85α，各種信號分子都需要與p85亞基結合后，才能激活PI3K，它的表達上調會引起PI3K的活性增強[5-6]。PI3K信號轉導系統的基因突變、缺失，蛋白表達異常，與人類多種惡性腫瘤的發生發展、生物學行為和預后有密切關系。PIK3R1表達異常與多種血液系統惡性腫瘤密切相關[9]，因此，我們選擇探索下調PIK3R1的表達來抑制骨髓瘤細胞的侵襲轉移的效果及可行性。

研究結果顯示轉染重組質粒表達載體pGenesil-1.1-PIK3R1后PIK3Rl的mRNA和蛋白表達均明顯抑制，同時MMP-2、MMP-9蛋白表達水平亦下降，TIMP-2則表達上調。MMP-2、MMP-9是與腫瘤侵襲密切相關的細胞因子，它們通過降解細胞外基質促進瘤細胞的擴散和轉移，TIMP則是MMPs的抑制劑，它可通過與MMPs的活化形式結合抑制基質金屬蛋白酶的活性。本實驗結果證實PIK3R1基因下調后TIMP-2表達上調，MMP-2、MMP-9表達下降，劃痕及Transwell實驗均證實瘤細胞的侵襲轉移能力顯著減弱。提示P13K/AKT不僅能直接調控MMP-2、MMP-9的表達，還可通過調節TIMP-2間接影響MMP-2、MMP-9的活性。

本研究結果表明，P13K信號轉導通路異常激活可直接抑制MMP-2、MMP-9的表達，同時還能激活TIMP-2的表達，從而抑制MMP-2、MMP-9的活性，達到促進腫瘤細胞侵襲轉移的目的。特異阻斷MM中P13K信號轉導通路的聯合基因治療能顯著減弱MM腫瘤細胞的侵襲能力，有望成為MM基因治療的新策略之一。

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(收稿：2014-08-07)

Experimental study on targeting PIK3R1 by RNAi suppressing Multiple Myeloma invasion and metastasis in vitro

Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Wu Di Liu Yalin Wxkl;'wertyuiop[ang Mengchang

Objective：To observe the inhibitory effects on the invasion and metastasis of Multiple Myeloma RPMI8226 cells line by small hairpin RNA targeting PIK3R1 in vitro. Methods：The recombinant plasmid vector expression vector which contained PIK3Rl shRNA was transfected into RPMI8226 cells. Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of P1K3Rl. ELESA was used to measure the change in the MMP-2 /MMP-9 expression．The invasion ability of the tumor cells was examined by Transwell tests．Resuits：pGenesil-1.1-PIK3R1 mediated shRNA targeting PIK3R1 dramatically down-regulated their expression in RPMI8226 cells. MMP-2 and MMP-9 were downregulated, and TIMP-2 was upregulated. The extracellular levels of MMP-2 and MMP-9 were decreased. Transwell showed that the number of cells invading through the matrigel in control, nonsense sequence．And pGenesil-1，1-PIK3R1 transfection groups were 115.5±3.9, 112.8±6.0, and 73.7±4.0 respectively. Conclusion：ShRNA targeting PIK3R1 down-regulated significantly their expression in a sequence-specific manner，and inhibited the invasion of Multiple Myeloma RPMI8226l cells in vitro．

Multiple myelom Neoplasm metastasis Gene therapy @PIK3R1

*陜西省科技攻關項目(2011k13-01-03)

▲通訊作者

多發性骨髓瘤 腫瘤轉移 基因治療 @PIK3R1

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.002