MACC1基因干涉對食管癌細胞Eca109體外和體內增殖的影響

西安交通大學第二附屬醫院胸外科(西安710004)

席俊峰△ 周 斌

MACC1基因干涉對食管癌細胞Eca109體外和體內增殖的影響

西安交通大學第二附屬醫院胸外科(西安710004)

席俊峰△周 斌

目的：探討MACC1對食管癌細胞Eca109增殖的影響。方法：利用慢病毒載體介導的小發卡RNA(shRNA)干涉食管癌細胞Eca109中MACC1的表達。利用MTT法和平板克隆試驗檢測MACC1對食管癌細胞增殖的影響，利用流式細胞儀檢測細胞周期的變化，最后利用裸鼠成瘤試驗檢測MACC1對食管癌細胞體內增值的影響。結果：成功建立MACC1干涉的食管癌細胞,MTT和平板克隆結果顯示MACC1基因干涉后抑制食管癌細胞的增殖,并使食管癌細胞發生G1期阻滯。體內試驗進一步證實MACC1干涉后抑制食管癌細胞在體內的增值。結論：干涉MACC1基因可抑制食管癌細胞的增殖。

MACC1是利用全基因組表達分析技術在結腸癌組織中發現的一個新基因[1]。研究結果顯示，MACC1在很多腫瘤組織中高表達，并且與多種惡性腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關，但其在食管癌細胞中的作用尚不清楚。本研究擬利用慢病毒建立MACC1干涉的Eca109細胞系,初步探討MACC1基因對食管癌細胞增殖的影響。

材料與方法

1 材 料 人食管癌細胞系Eca109購自中國科學院細胞庫。293T細胞由第四軍醫大學唐都醫院胸外科鐘代星博士提供。慢病毒干涉構建質粒pLKO.1-TRC control、pLKO.1- scramble shRNA、psPAX2、pMD2.G購自Addgene公司。兔抗人MACC1多克隆抗體購自abcam公司,小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自博士德公司。RT-PCR試劑盒及引物購自Takara公司。脂質體2000和嘌呤霉素購自Invitrogen公司。

2 構建MACC1干涉的Eca109穩轉細胞系 將兩個MACC1 shRNA(shMACC1-1：AAGATTGGACTTGTACACTGC,shMACC1-2: AAGCTTGGAAAAGGCTGGAGG)分別導入到pLKO.1載體中[2]。按照脂質體2000說明將pLKO.1-shRNA、psPAX2、pMD2.G三種質粒按照比例轉入到293T細胞內。12h后移除轉染試劑，加入培養基繼續培養48h并收集病毒液，0.45 μm濾器過濾。將病毒液滴入食管癌細胞Eca109中(大約70%密度),培養48h加入嘌呤霉素(1mg/ml)。經3周的篩選培養,挑出單個克隆并擴增,建立對照細胞系Eca109-SC和MACC1干涉的兩組細胞系Eca109-S1和Eca109-S2。

3 RT-PCR檢測各組細胞內MACC1 mRNA的表達 按Trizol試劑盒說明書分別提取各組細胞總RNA。RT-PCR反應按照試劑盒說明進行操作。MACC1引物序列：5’-CCTTCGTGGTAATAATGCTTCC-3’ ，5’-AGGGCTTCCATTGTATTGAGGT-3’。GAPDH引物序列： 5’-GCCTCAAGATCATCAGCAAT -3’，5’- AGGTCCACCACTGACACGTT -3’。反應條件為：94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30 s,反應30個循環；最后72℃ 10 min，4℃保存。然后行agrose凝膠電泳,紫外燈下觀察結果,并照相。

4 Western-blot檢測各組細胞內MACC1 蛋白的表達 分別提取細胞的總蛋白。按照蛋白定量試劑盒說明書 BCA 法進行總蛋白定量,取 50μg蛋白質樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳后,將凝膠上的蛋白轉移至 NC膜上,標記預染marker的位置。50mg/L 脫脂牛奶封閉，一抗為1∶500 稀釋的抗MACC1 mAb,4℃,過夜,二抗室溫孵育1h,暗室內加增強化學發光試劑 ( ECL ),X光片顯影。

5 MTT檢測各組細胞的增值情況 取對數生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞分別加入到96孔板中,每孔約5×103細胞,培養基體積為200ml。每點設4個復孔,共鋪7塊96孔板。放置孵箱內常規培養，隔兩天更換一次培養基。各組細胞接種后每24 h分別收集一次細胞樣品,收集7 d；在酶聯免疫儀上選擇490nm波長測定吸光值。最后統計數據,繪制生長曲線。

6 平板克隆試驗檢測各組細胞克隆形成情況 取對數生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞分別接種于直徑為 6cm 的培養皿,每個皿接種的細胞數控制在200個左右,10ml 含每組設3個復孔。十字形晃動使細胞均勻分布。培養14d。以后每隔兩天更換培養基一次。培養 14d后,當培養皿內出現肉眼可見的細胞克隆時中止培養,棄去培養基。PBS洗滌3次,加入5 ml甲醇固定15 min。棄去固定液,加入 2ml 姬姆薩應用液染色20min。用蒸餾水緩慢洗去姬姆薩染液,將培養皿放置于空氣中干燥后倒置；用肉眼直接計數紫色的細胞克隆數并拍照。進行統計分析，繪制直方圖。

7 流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化 取對數生長的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞，無血清DMEM 培養基24h，然后將培養基換成含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養，待細胞融合度80%～90%時收集細胞，做周期分析。細胞固定：胰酶將細胞消化下來后，用10%胎牛血清的DMEM培養基終止反應，800rpm，5min。然后PBS洗兩次，70%乙醇1ml重懸細胞，充分吹勻，避免細胞形成團塊。然后放置4℃冰箱過夜，離心棄去上清后用PBS洗滌細胞2次；用100 μl PBS重懸各組細胞，300 μl碘化丙啶染色液15 min。用FCM檢測。細胞周期分析采用美國Becton.Diekinson公司的CellQuit Plot分析軟件。

8 裸鼠成瘤試驗 取對數生長期的Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞,常規消化細胞、離心并計數，取5×106個細胞,再次離心收集細胞沉淀。用0.2ml生理鹽水或者PBS重懸細胞,分別移至0.5ml的EP管內,封口膜封口。將裸鼠側腹部皮膚消毒。用1ml注射器吸取細胞懸液,將其注射到裸鼠皮下。每天觀察裸鼠一般狀況及腫瘤生長情況,記錄腫瘤生成的潛伏期,測量腫瘤的體積，接種細胞后第28 天,用頸椎脫臼法處死裸鼠,解剖取出瘤體。用微量天平稱重，按以下公式計算腫瘤體積，腫瘤體積=長徑×短徑2/2,根據腫瘤體繪制腫瘤生長曲線。

9 統計學分析 使用SPSS 17.0版本統計軟件對實驗中所得到的數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示,使用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 成功構建MACC1干涉的Eca109穩轉細胞系 使用RT-PCR 方法檢測MACC1 mRNA在Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2的表達，結果顯示：與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2細胞中MACC1 mRNA表達量顯著減少(P<0.01)(圖1A)。使用Western-blot方法檢測MACC1蛋白在Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2的表達，結果顯示：與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2細胞中MACC1 蛋白表達量顯著減少(P<0.01)(圖1B)。

圖1 各組細胞中MACC1 mRNA 和蛋白的相對變化

2 MACC1基因干涉抑制Eca109細胞的增殖 以Eca109-SC細胞為對照，利用MTT法檢測Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三種細胞的增值情況并繪制細胞生長曲線，結果顯示，與對照組相比，Eca109-S1和Eca109-S2兩組細胞生長明顯受到抑制，具有統計學意義(P<0.05)。而Eca109-S1和Eca109-S2兩組細胞之間未見明顯差異(圖2A)。平板克隆結果顯示，經過14天的培養，Eca109- SC組克隆數為：126±12，Eca109-S1和Eca109-S2兩組克隆數分別為：83±8和96±10，明顯少于對照組，具有統計學意義(P<0.05)(圖2B)。

圖2 MACC1干涉對食管癌細胞Eca109增殖的影響

3 流式細胞術(FCM)測定細胞周期變化 采用流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示，與對照組Eca109-SC相比，Eca109-S1和Eca109-S2兩組細胞G0/G1周期細胞明顯增加(P<0.01)，而G2/M期和S期細胞周期分部無明顯差異。表明干涉MACC1后，細胞發生G1期阻滯，從而抑制了細胞的增值(圖3)。

圖3 MACC1干涉對食管癌細胞Eca109細胞周期的改變

4 MACC1基因干涉抑制Eca109細胞體內成瘤能力 種植Eca109-SC、Eca109-S1和Eca109-S2三組細胞的裸鼠,在接種后7d左右均形成可見的腫瘤結節,每3天使用游標卡尺測量腫瘤體積變化，Eca109-SC組腫瘤生長迅速，而Eca109-S1和Eca109-S2兩組腫瘤相對較慢。接種四周后統一頸椎脫臼法處死裸鼠，解剖出腫瘤，測量體積并稱重，結果顯示，Eca109-S1和Eca109-S2兩組腫瘤體積和重量明顯小于對照組腫瘤體積和重量，具有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 MACC1干涉對食管癌細胞Eca109體內成瘤的影響

討 論

2009年Ulrike等[1]通過全基因組表達分析技術分析結腸癌的癌灶轉移灶及正常結腸組織之間基因表達差異時發現一個新的基因-MACC1，發現MACC1是診斷結腸癌轉移和預測結腸癌患者無病生存期的一個獨立指標，并且證明MACC1通過HGF/c-Met信號轉導通路促進腫瘤細胞的增值、浸潤和轉移。MACC1基因定位于人類7號染色體(7p21.1),由7個外顯子和6個內含子構成,其cDNA序列中含2559個核苷酸序列。MACC1基因編碼由852個氨基酸組成的蛋白質，其主要結構包括：SH3結構域、ZU5結構域、DD1區和DD2區結構片段[3]。進一步的實驗研究表明,MACC1在多種實體腫瘤中表達增高,比如：胃癌、肝癌[4]、肺癌[5]和卵巢癌[6]等,并且能夠很好地預測患者的預后。在胰腺癌患者的血清中,與健康人相比,MACC1的蛋白水平明顯升高,并MACC1的蛋白水平與腫瘤的TNM分期,淋巴結轉移和遠處轉移密切相關。在胰腺癌細胞中干涉MACC1的表達后,可明顯抑制細胞的增值、轉移以及EMT,而且MACC1可作為吉西他濱治療胰腺癌效果的預測分子,提示MACC1可能有助于胰腺癌的個體化治療[7]。王建軍等[8]報道MACC1蛋白在食管癌組織

中的表達水平高于癌旁組織，MACC1蛋白的表達水平與食管癌的TNM分期和淋巴結轉移及分化程度顯著相關，提示MACC1的異常表達與食管癌的發生、發展密切相關。

本實驗利用慢病毒載體成功構建MACC1基因干涉的Eca109穩轉細胞系，為深入研究MACC1基因在食管癌的作用提供了試驗基礎。MTT試驗和平板克隆試驗結果顯示食管癌細胞Eca109中MACC1基因干涉后，其生長速度以及克隆數明顯下降，提示干涉MACC1基因可抑制食管癌細胞Eca109的增殖能力。細胞周期分析結果顯示MACC1通過使食管癌細胞發生G1期阻滯，從而抑制細胞的增殖。體內試驗進一步證實：干涉MACC1基因可抑制食管癌細胞Eca109在裸鼠體內的成瘤能力。綜合上述研究，提示MACC1有可能成為食管癌基因治療的一個新靶點。其分子機制還需要我們進一步研究。

[1] Stein U.MACC1, a newly identified key regulator of HGF-MET signaling, predicts colon cancer metastasis[J].Nat Med, 2009,15(1)：59-67.

[2] Xu CS.MSP58 knockdown inhibits the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma in vitro and in vivo[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012,13(7)：3233-3238.

[3] 蔡新生 ,閆朝光,王廣春,等.MACC1基因在胃癌中的表達及臨床意義[J]. 醫藥前沿, 2012(24)：209.

[4] 劉清泉,劉青光,昝獻峰,等.MACC1基因在肝細胞癌中的表達及臨床意義[J].華中科技大學學報：醫學版， 2010,39(1)：22-24,28.

[5] Shimokawa H.Overexpression of MACC1 mRNA in lung adenocarcinoma is associated with postoperative recurrence[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2011,141(4)：895-898.

[6] Zhang R.Effects of metastasis-associated in colon cancer 1 inhibition by small hairpin RNA on ovarian carcinoma OVCAR-3 cells[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2011,30：83.

[7] Wang G.MACC1：A potential molecule associated with pancreatic cancer metastasis and chemoresistance[J]. Oncol Lett, 2012, 4(4),783-791.

[8] 王建軍,洪 強,胡叢崗,等.結腸癌轉移相關基因1蛋白在食管癌組織中的表達及其意義[J].中華醫學雜志,2013, 93(32)：2584-2586.

(收稿：2014-03-10)

△陜西省榆林市第一醫院

食管腫瘤 基因表達調控,腫瘤 細胞增殖 @MACC1基因

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.005