電針對阿爾茨海默病大鼠認知功能及海馬Nogo-A、NgR表達的影響*

西安交通大學第二附屬醫院老年神經科(西安710004)

王 輝 何 婭▲ 陳松盛 馬巧亞 王銳利

電針對阿爾茨海默病大鼠認知功能及海馬Nogo-A、NgR表達的影響*

西安交通大學第二附屬醫院老年神經科(西安710004)

王 輝 何 婭▲陳松盛 馬巧亞 王銳利

目的：了解電針對阿爾茨海默病(AD)大鼠認知功能及海馬區Nogo-A、NgR表達的影響。方法：雙側海馬注射Aβ1-40制備大鼠AD模型，1周后加電針治療，第5周行水迷宮實驗評價大鼠認知功能，并用Western Blot方法檢測海馬區Nogo-A、NgR表達的變化。結果：水迷宮實驗中逃避潛伏期在AD組大鼠較假手術組顯著延長(P<0.05),而AD+電針組較AD組顯著縮短(P<0.05)。原平臺所在象限的游泳時間占總時間的比值AD組大鼠顯著低于假手術組(P<0.05),而AD+電針組則顯著高于AD組(P<0.05)。Western Blot實驗顯示：AD組大鼠較假手術組Nogo-A表達增高,NgR表達降低，AD+電針組大鼠較AD組Nogo-A表達則相對下調，NgR表達相對上調。結論：AD大鼠海馬區Nogo-A表達增高,NgR表達降低,可能與AD的病理改變有一定聯系。電針治療能明顯改善AD大鼠的認知功能,上調NgR表達可能是其機制之一。

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，主要表現為進行性的記憶力減退、日常生活能力下降和精神行為異常等，它嚴重影響患者的生存質量，也給社會和家庭帶來了沉重的負擔。細胞外β淀粉樣蛋白(Amyloid protein β,Aβ)沉積形成的老年斑和tau蛋白異常聚集導致的神經纖維原纏結是AD兩個特征性的病理變化。研究認為[1-4],AD患者腦內海馬區出現神經軸突生長抑制因子Nogo-A及其受體NgR的異常表達,且這些蛋白異常表達與AD的病理改變有一定的聯系。電針在臨床上常用于中樞神經系統疾病的治療,療效肯定,但其作用機制不詳[5-6]。本實驗用Aβ1-40雙側海馬區注射制備大鼠AD模型,加用電針治療,采用水迷宮實驗評價大鼠認知功能,并用Western Blot方法檢測大鼠海馬區Nogo-A、NgR蛋白表達的變化,了解電針對阿爾茨海默病大鼠認知功能的影響及其可能的機制。

材料與方法

1 材 料 成年健康清潔級雄性SD大鼠36只(220～250g),由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供。自由飼養1周,行水迷宮實驗排除訓練異常的大鼠。動物隨機分為3組：假手術組12只、AD模型組12只、AD模型+電針治療組12只，術前12h禁食,自由飲水。Aβ1-40、NgR抗體為海南醫學院馬琳教授惠贈,Aβ1-40使用前溶于滅菌的雙蒸水配成濃度5g/L的溶液,37℃孵育7d。Nogo-A抗體購自Santa Cruz公司。

2 方 法 ①大鼠AD模型的制備：按照2%異戊巴比妥50mg/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后的大鼠俯臥于大鼠立體定向儀上,門齒鉤、耳棒固定頭部,使前后囟在同一平面上,剪去頭頂部毛發,正中切口,分離暴露前囟。參照大鼠腦立體定向圖譜,按照海馬CA1坐標確定進針點位于前囟后3mm，向左右各旁開2.2mm，做好標記，顱鉆鉆一小孔，深度以鉆透顱骨不傷及硬腦膜為宜,使用立體定向儀配套的夾持器將微量注射器從定位處緩慢穿入，深度為2.8mm,緩慢注入Aβ1-40 1μl,注射時間為5min，留針5min，緩慢退出微量注射器。雙側均注射結束后用牙科水泥封固顱骨孔，縫合切口，局部消毒，術后每只大鼠腹腔注射青霉素8萬U。術后將大鼠保持側臥位，60W白炙燈照射使肛溫保持在 37℃左右，注意吸痰保持呼吸道通暢，待大鼠清醒后放回籠內。假手術組除雙側注入生理鹽水外，其余操作同手術組。②電針治療：AD+電針組大鼠于AD模型制備后1周行電針治療。參考《中國獸醫針灸學》定位[7]，于大鼠頭部正中兩耳間取“百會”，前肢內側，距腕關節約3mm的尺橈骨間取“內關”，第2腰椎棘突下旁開1寸取“腎俞”，大鼠后肢膝部外側前下方取“足三里”。采用28號0.5寸不銹鋼毫針，“百會”平刺1～2mm，“腎俞”稍向內斜刺5mm，“內關”直刺1mm，行提插捻轉平補平瀉法，“足三里”直刺5mm，加用“三元牌”電針儀(型號G6805-Ⅲ)，采用疏密波刺激以上穴位,頻率2Hz,電壓為2V,每次20min,連續治療20d。③水迷宮實驗：所有大鼠進入實驗前及AD模型制備后第5周分別行Morris水迷宮實驗。Morris水迷宮為直徑1.2m的圓形水池,水深約30cm,水溫23～25℃左右,迷宮上方裝有攝像頭并與計算機相連，應用水迷宮分析軟件可記錄大鼠的游泳軌跡等數據。迷宮池壁內側標明4個入水點,將水池隨意分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限,在象限Ⅱ中央設置一個平臺,平臺距水面約2cm。獲得性訓練：每天4次,將大鼠分別從4個象限頭朝池壁投入水池,記錄其尋找到平臺的時間為逃避潛伏期,最長限制時間為120s,若120s內未找到平臺，則逃避潛伏期記為120s，并由實驗人員引導其游到平臺，讓其在平臺休息30s后擦干身體放入籠中休息，再投入其它大鼠。所有大鼠進入實驗前進行1天的獲得性訓練,每只大鼠4次，若其中有2次不能在120s內找到隱藏的平臺，則被視為訓練異常,不納入實驗。AD模型制備后第5周進行的水迷宮實驗共有兩項內容，其中獲得性訓練共進行5d(分別記為D1～D5)，每天4次，取4次的均值記為當天的逃避潛伏期數據。第二項內容是探查訓練：完成獲得性訓練的第二天撤去平臺，記錄其在一定時間內的游泳軌跡，計算大鼠在象限Ⅱ(原平臺所在象限)游泳的時間與總時間的比值，考察大鼠對原平臺的記憶。④Nogo-A、NgR蛋白檢測：采用Western blot方法進行。水迷宮實驗結束后大鼠于10%水合氯醛3.5ml/kg體重腹腔注射麻醉,斷頭取腦,迅速分離海馬組織,液氮速凍,后置于-80℃冰箱保存。檢測時取大鼠海馬組織勻漿后提取總蛋白，用蛋白試劑盒定量,將3組大鼠海馬的蛋白樣品上樣,經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,再將電泳凝膠上的蛋白質條帶轉移至PVDF膜上,封閉后分別加入抗Nogo-A、NgR抗體,后加入酶標二抗依次反應,ECL顯色。結果用光密度掃描計算機進行圖像分析,以背景光密度值進行標準校正,計算Nogo-A、NgR蛋白表達的相對量。

結 果

1 水迷宮實驗 在獲得性訓練中，每組大鼠的逃避潛伏期均隨著訓練天數的增多而逐漸縮短。與假手術組相比,AD模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長,差異有統計學意義(P<0.05)。從第2天開始,與AD組相比，AD+電針治療組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。(見表1)。在探查訓練中,AD組大鼠在象限Ⅱ的游泳時間占總時間的比值明顯低于假手術組大鼠，差異有統計學差異(P<0.05)。AD+電針組大鼠在象限Ⅱ的游泳時間占總時間的比值明顯高于AD組大鼠，差異有統計性意義(P<0.05)。(見表2)。

表1 獲得性訓練中大鼠的逃避潛伏期

注：與假手術組比較*P<0.05；與AD組比較**P<0.05

表2 探查訓練中大鼠在水池各象限游泳的時間與總時間的比值

注：與假手術組比較*P<0.05；與AD組比較**P<0.05

2 Nogo-A、NgR蛋白檢測 Western Blot實驗顯示：相對于假手術組，AD組大鼠Nogo-A表達明顯增高，NgR表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)(見圖1)；而相對于AD組，AD+電針組大鼠Nogo-A表達下調，NgR表達上調, 差異均有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

圖1 三組大鼠Nogo-A蛋白Western Blot結果(*P<0.05)

圖2 三組大鼠NgR蛋白Western Blot結果(*P<0.05)

討 論

海馬是參與學習記憶的重要器官，AD的病理改變首先出現在海馬-內嗅皮層,影像學的研究也發現AD患者雙側海馬體積明顯縮小。在本實驗中,大鼠雙側海馬注射Aβ1-40后表現出明顯的認知功能下降癥狀,提示AD模型構建成功。本實驗中AD+電針治療組大鼠學習記憶能力雖明顯低于假手術組,但仍顯著高于AD組，提示電針治療能明顯改善阿爾茨海默病大鼠的認知功能。

Nogo-A是一種抑制神經軸突生長的髓鞘相關蛋白，屬于內質網膜蛋白RTN家族成員，被認為是阻礙中樞神經系統受損神經軸突再生修復的重要因素。NgR是位于細胞膜表面能夠與Nogo-A的Nogo-66區域特異結合的蛋白。研究發現[3]NgR與P75或TAJ/TROY、Lingo-1組成受體復合物，Nogo-A與其結合后，激活下游的RhoA激酶，使無活性的Rho-GDP轉變成有活性的Rho-GTP,后者進而激活ROCK，通過影響肌動-肌球蛋白系統導致軸突生長錐的塌陷，發揮其神經生長抑制作用。Nogo-A、NgR在動物的中樞神經系統廣泛表達。隨著研究的深入,人們逐漸發現Nogo-A、NgR與阿爾茨海默病的發生發展有一定的聯系。

He等[8]研究發現RTN家族成員可與β淀粉樣前體蛋白APP的轉換酶BACE1結合，減少對APP的酶切，抑制Aβ產生。Park等[9]研究發現NgR與APP可相互作用減少Aβ分泌，敲除NgR基因的AD小鼠Aβ水平升高，老年斑形成增加。同年他們還報道[10]，在敲除NgR基因的AD小鼠，皮下給予可溶性的Nogo受體片段NgR-Fc能夠減少腦內Aβ產生，提高動物的認知能力。對于NgR在海馬區的表達有研究得出了不同的結論，唐寒芬等[11]研究發現在阿爾茨海默病大鼠海馬區NgR表達下降。雖然NgR作為阿爾茨海默病一個可能的治療方向引起了研究者的廣泛關注，但對于Nogo-A及NgR在AD發生發展中的作用尚需進一步的研究。

傳統醫學電針刺激相應穴位能夠對多種中樞神經系統疾病產生明顯的神經保護作用，已有很多研究[12]證實電針對阿爾茨海默病療效肯定，但機制尚不明確。目前有很多相關的學說，如：調節神經遞質的釋放、抗氧化應激、改善神經元突觸的可塑性、提高神經營養因子的含量、抑制tau蛋白的表達、降低Aβ的水平、上調自噬活性等。

本實驗采用Western Blot檢測大鼠海馬區Nogo-A、NgR蛋白的表達，發現在AD組大鼠Nogo-A表達較假手術組明顯增高，NgR表達則明顯降低。與唐寒芬等的研究結果一致，而與Zhu等人的研究結果似乎矛盾。考慮可能的原因：Zhu等的研究曾提示，在阿爾茨海默病患者海馬的CA1、CA2區NgR表達陽性的細胞占整個錐體層細胞的百分比明顯高于對照組患者，而在CA3、CA4區域未觀察到這種差別。本實驗中未對海馬組織的亞結構進一步詳細區分，且動物樣本量不夠大，可能造成實驗結果的不一致。另外，Zhu等的研究對象是AD患者，與大鼠的表達是否一致尚需進一步研究。加之研究方法以及AD病程等方面的不一致也是可能的原因。由于Nogo-A與BACE1以及NgR與APP有相互作用位點，因此Nogo-A與NgR的異常表達可能與AD的病理改變有一定的聯系。

實驗中觀察到，相對于AD組，AD+電針治療組大鼠海馬區Nogo-A表達下調,差異有統計學意義。參考He等的研究，Nogo-A作為Aβ沉積的負性調控因子，表達下調有利于Aβ沉積，不利于大鼠認知功能的改善，因此我們推斷Nogo-A表達下調可能與神經再生方面的調控有關。同時我們還觀察到，AD+電針治療組大鼠海馬區NgR表達上調。參考Park等人的研究，NgR能夠減少Aβ的產生，從而有利于認知功能的改善，這可能是電針治療改善AD大鼠認知功能的機制之一。

[1] Gil V, Nicolas O, Mingorance A,etal. Nogo-A expression in the human hippocampus in normal aging and in Alzheimer disease[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2006, 65(5)：433-444.

[2] 劉 濤.阿爾茨海默病信號轉導機制的研究進展[J].陜西醫學雜志,2012,41(6)：742-743,759.

[3] 劉 濤,張榮超,黃 悅.跑臺運動對D-半乳糖致阿爾茨海默病模型大鼠干預的實驗研究[J].陜西醫學雜志,2014,43(2)：149-151,157.

[4] Schmandke A,Schmandke A,Schwab ME.Nogo-A：Multiple Roles in CNS Development, Maintenance, and Disease[J].Neuroscientist,2014,20(4)：372-386.

[5] 唐純志,賴新生,楊君軍,等.電針對老年性癡呆大鼠腦內SOD、MDA、GSH-Px影響的實驗研究[J].陜西中醫,2005 26(2)：180-181.

[6] 汪 艷,張兆蓬,王學員.電針配合重復經顱磁刺激治療血管性癡呆49例[J].陜西中醫,2012,33(1)：82-84.

[7] 于 船.中國獸醫針灸學[M].北京：農業出版社,1984：212.

[8] He W,Lu Y, Qahwash I,etal.Reticulon family members modulate BACE1 activity and amyloid-beta peptide generation[J].Nat Med,2004,10(9)：959-965.

[9] Park JH,Gimbel DA,GrandPre T,etal.Alzheimer precursor protein interaction with the Nogo-66 receptor reduces amyloid-beta plaque deposition[J].J Neurosci,2006,26(5)：1386-1395.

[10] Park JH,Widi GA,Gimbel DA,etal.Subcutaneous Nogo receptor removes brain amyloid-beta and improves spatial memory in Alzheimer's transgenic mice[J].J Neurosci,2006,26(51)：13279-13286.

[11] 唐寒芬.腦靈湯對阿爾茨海默病模型大鼠海馬CA3區域Nogo-A和NgR表達變化的影響[D].中南大學,2011.

[12] 朱 晶,國海東,邵水金.針灸治療阿爾茨海默病機制的研究進展[J].針刺研究,2012,37(5)：422-425.

(收稿：2014-09-22)

Effects of electro-acupuncture on cognitive functions and expression of Nogo-A and NgR in hippocampus of Alzheimer’s disease rats

Department of Elderly Neurology, The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Wang Hui He Ya Chen Songsheng et al

Objective：To observe the effects of electro-acupuncture on cognitive functions and expression of Nogo-A and NgR in hippocampus of Alzheimer’s disease rats.Methods：The rats of Alzheimer’s disease were established by injection β amyloid 1-40 into bilateral hippocampus and were treated with electro-acupuncture for twenty days after one week. The cognitive functions were evaluated by Morris water maze testing in fifth week and the expression of Nogo-A and NgR in hippocampus were detected by Western Blot.Results：The escape latency of rats in AD group was significantly longer than that in sham-operated group and was significantly shorter in electro-acupuncture group than that in AD group. The percentage of swimming time in the original quadrant in AD group was significantly lower than that in sham-operated group and was significantly higher in electro-acupuncture group than in AD group. The down-regulated Nogo-A and up-regulated NgR were discovered in AD group and were corrected by electro-acupuncture.Conclusion：The Nogo-A up-regulation and NgR down-regulation in AD rats have relationship with the pathological changes. The treatments of electro-acupuncture obviously improved the cognitive functions, of which the change of NgR expression are supposed to be one of the mechanisms.

Alzheimer disease Hippocampus Electroacupuncture @Nogo-A @NgR

*陜西省科技攻關項目資助[2006K13-G1(7)]

▲通訊作者

阿爾茨海默病 海馬 電針 @Nogo-A @NgR

R749.16

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.006