肌細胞增強因子2A基因P279L變異與冠心病的關(guān)系*

西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科(西安710003)

張 濤 慕玉東△ 馬前峰

肌細胞增強因子2A基因P279L變異與冠心病的關(guān)系*

西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科(西安710003)

張 濤 慕玉東△馬前峰

目的：探討肌細胞增強因子2A基因P279L變異是否與冠心病相關(guān)。方法：選擇西北地區(qū)漢族人385例，采用酚氯法提取全基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系結(jié)合測序的方法檢測MEF2A基因多態(tài)性。結(jié)果：冠心病組L、P等位基因的頻率分別為16.53%和83.47%；對照組L、P等位基因的頻率分別為5.48%和94.52%,MEF2A-P279L基因型在冠心病組和對照組的分布存在顯著性的差異(P<0.01),而且L等位基因的分布頻率在冠心病組顯著高于對照組(P<0.01)。結(jié)論：MEF2A-P279L基因型在冠心病組和對照組的分布有顯著性差異，與冠狀動脈病變的嚴(yán)重程度顯著相關(guān),L等位基因的攜帶者冠心病發(fā)病率顯著高于非攜帶者,而且冠脈的病變更為嚴(yán)重。

2003年Wang等[1]發(fā)現(xiàn)了人類肌細胞增強因子2(Myocyte enhancer factor 2A，MEF2A)編碼的基因存在突變,目前國內(nèi)對MEF2A-P279L的研究報道較少，為了明確MEF2A-P279L基因多態(tài)性對我國人群冠心病的影響，及MEF2A-P279L基因多態(tài)性的種族差異。本研究采用酚氯法提取全基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)體系結(jié)合測序的方法檢測385例西北地區(qū)漢族人的MEF2A基因多態(tài)性。

對象與方法

1 對 象 收集我科2011年1月至2012年12月期間行冠狀動脈造影的住院患者，共385例。根據(jù)結(jié)果分為冠心病組239例，男152例，女87例，年齡55.6±10.3歲；對照組146例，男83例，女63例，年齡52.6±11.2歲；均為漢族人。兩組在性別和年齡之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；入選的研究病例均排除肝腎功能不全、腫瘤等疾病，而且所研究的病例之間無血緣關(guān)系。

2 方 法 ①標(biāo)本收集：于入院次日清晨空腹采取20ml靜脈血，離心后將上清液及血細胞分裝于血漿試管和血細胞試管，于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩＂贒NA的提取：采用酚氯法提取DNA，即血細胞經(jīng)蛋白酶消化、采用苯酚和氯仿提取，然后采用異丙醇沉淀提取物等方法。③DNA的標(biāo)本分析：采用分光光度計和瓊脂糖電泳對已提取的DNA標(biāo)本進行純度和濃度的檢測。用OD260(nm)和OD280(nm)分別來表示DNA和蛋白質(zhì)的吸光度，用OD260/OD280的比值來表示DNA純度。對于DNA片段是否降解可以采用瓊脂糖電泳的方法進行識別。④PCR擴增MEF2A目的基因：PCR條件：反應(yīng)體系總體積15μl，循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。由陜西博森生物公司合成引物，引物如下：上游5’CACTTTATTGAATGATATTTTTCCCC 3’；下游5’AGGCATCATGCCCTTGCTTTA 3’。⑤RFLP檢測MEF2A-P279L基因多態(tài)性：Dra I限制性內(nèi)切酶1 μl(2.5 u/μl)，內(nèi)切酶10×NEbuffer 2μl，PCR產(chǎn)物8-10μl，加去離子水致反應(yīng)體系20μl。將反應(yīng)體系置于37℃水浴箱過夜16～24h。采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色對酶切產(chǎn)物進行分型。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)和計量資料分別用頻數(shù)值及均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用χ2檢驗對等位基因頻率及基因型頻率進行差異性比較，P<0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 MEF2A-P279L基因多態(tài)性的分布 見表1、2。冠心病組L、P等位基因的頻率分別為16.53%和83.47%，對照組的L、P等位基因的頻率分別為5.48%和94.52%，兩組間等位基因分布頻率存在顯著性差異，冠心病組的L等位基因分布頻率顯著高于對照組(P<0.01)

表1 MEF2A-P279L多態(tài)性的分布

表2 MEF2A-P279L等位基因頻數(shù)的分布

2 MEF2A-P279L與冠脈病變支數(shù)的相關(guān)性 見表3、4。MEF2A-P279L不同基因型與顯著性冠脈病變以及嚴(yán)重程度存在顯著性差異(P<0.01)；攜帶L等位基因的冠脈病變程度顯著較P等位基因的嚴(yán)重(P<0.01)。

表3 MEF2A-P279L基因型與冠脈病變支數(shù)的相關(guān)性

表4 MEF2A-P279L等位基因頻數(shù)與冠脈病變支數(shù)的相關(guān)性

討 論

自2003年研究發(fā)現(xiàn)人類肌細胞增強因子2基因的突變影響并降低了MEF2A因子的轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的合成，從而對血管內(nèi)皮進行破壞，促進血管內(nèi)皮脂質(zhì)的沉積以及血管炎性介質(zhì)的聚集，最終啟動了動脈粥樣硬化的病理生理過程。因此，MEF2A被認為是第一個被發(fā)現(xiàn)的冠心病的致病基因[1]。

本研究結(jié)果顯示：MEF2A-P279L基因型的分布在冠心病組和對照組存在顯著性差異(P<0.01)。說明MEF2A-P279L在我國西北地區(qū)漢族人群中分布存在多態(tài)性，而且是增加冠心病易患的遺傳因素。文獻報道[2]：P279L等位基因在西班牙人群中存在突變情況，病例組中P279L突變基因攜帶者的頻率明顯高于對照組，在西班牙人群中該突變型可能與冠心病、心肌梗死升高的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，這與我們的研究結(jié)果相一致。但Kajimoto等[3]以及Weng等[4]研究未發(fā)現(xiàn)在病例組中P279L存在缺失突變，從而提出MEF2A基因的這種變異應(yīng)該是一種極罕見的多態(tài)，而不是所謂的致病缺失突變。李婧等[5]對冠心病組和對照組人群中的MEF2A基因外顯子進行掃描時，未發(fā)現(xiàn)P279L堿基突變。這些研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果不一致，這些差異可能與不同地域、不同種群的MEF2A基因多態(tài)性分布不同以及對冠脈病變嚴(yán)重程度的影響也不同。

本研究結(jié)果揭示了MEF2A-279P/L基因型在西北地區(qū)漢族人群中的分布情況、及其與冠心病和冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，從基因水平對冠心病進行早期預(yù)防、早期診斷，為治療冠心病提供新的依據(jù)。

[1] Wang Q,Fan C,Topol SE,etal.Mutation of MEF2A in an inherited disorder with features of coronary artery disease[J].Science,2003,302(5650)：1578-1581．

[2] Gonzalez P,Garcia-Castro M,Reguero JR,etal.The Pr0279Leu variant in the transcription factor MEF2A is associated with myocardial infarction[J].Med Genet,2006,43(2)：167-169.

[3] Kajimoto K，Shioji K,Tago N,etal．Assessment of MEF2A mutations in Myocardial infarction in Japanese patient[J].Circ,2005,69：1192-1195.

[4] Weng L,Kavaslar N,Ustaszewska A,etal.Lack of MEF2A mutations in coronary artery disease[J].Clin Invest,2005,115(4)：1016-1020.

[5] 李 婧,楊鈞國,陳漢想,等.冠狀動脈粥樣硬化性心臟病新致病基因MEF2A第7外顯子突變的檢測[J].中國臨床康復(fù)雜志,2006,10(24)：72-74.

(收稿：2014-09-16)

Association of MEF2A-P279L single nucleotide polymorphism (SNP) with CHD

The Central Hospital of Xi’an (Xi’an 710003)

Zhang Tao Mu Yudong Ma Qianfeng

Objectives：To investigate the relationship between the distribution of Myocyte enhancer factor 2A (MEF2A) gene P279L polymorphism and CHD in Han nationality in Chinese North -Western area. Methods：Three hundred and eighty five Han ethnic subjects .DNA was extracted by proteinase K digestion , phenol and chloroform extraction as well as isopropanol precipitation. The polymerase chain reaction(PCR)-restriction fragment length polymorphisms (RFLP) in conjunction with sequencing were employed to test the single nucleotide polymorphisms (SNPs) in Myocyte enhancer factor 2A (MEF2A). Results：Lallelic frequency was significantly higher that in CHD group than that in control group,CHD group 16.53%，control group 5.48% (P<0.01)，Lallele was related with more severity of atherosclerosis in the coronary artery than P allele(P<0.01).Conclusion：There is significantly statistical difference of distribution frequency and severity of atherosclerosis in the coronary artery of three genotypes of MEF2A-P279L polymorphism in CHD and control group, but also L allele is related with more morbility of CHD and severity of atherosclerosis in the coronary artery.

Coronary disease Gene expression @MEF2A-P279L

*西安市科技計劃基金項目(2011HM1115)

△陜西省腫瘤醫(yī)院檢驗科

冠狀動脈疾病 基因表達 @肌細胞增強因子2A基因

R589.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.011