茵陳蒿湯上調樹突狀細胞Axl 抑制慢加急性肝衰竭大鼠肝臟樹突狀細胞凋亡*

曹承樓 孫克偉 胡 莉 陳 斌

1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院肝病科 (安徽 合肥，230031) 2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院肝病科

慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝病基礎上出現的急性肝功能失代償，表現為慢性肝病病理損害的基礎上，發生新的程度不等的肝細胞壞死性病變，是嚴重威脅慢性肝病患者，尤其是慢性病毒性肝炎患者的疾病。ACLF 屬中醫黃疸病范疇，茵陳蒿湯作為治療陽黃病的經典方劑，常作為基礎方藥用于ACLF 的治療中。但其治療的現代藥理作用機制遠未闡明。我們擬從DC 的凋亡及Axl 信號對凋亡的調控作用探討其作用機理，以揭示其治療ACLF 的免疫病理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠70 只，體重150～200g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司，質量合格證No.43006700000440。動物飼育于中南大學附屬湘雅三醫院動物實驗中心，實驗動物設施許可證號SYXK(湘)2010-001，實驗動物設施使用證明號No.00044537。實驗前1 周領取動物，每籠2～3 只分籠飼養，自由進食與飲水。

1.2 藥物及主要試劑與設備 茵陳蒿湯液配方比例為茵陳蒿18g、大黃6g、梔子12g，購于湖南中醫醫藥大學第一附屬醫院中藥房(茵陳蒿產地:河北;大黃產地:四川;梔子產地:湖南)，水煎煮濃縮成生藥含量為0.9g/ml 的藥液。牛血清白蛋白、脂多糖(LPS)(Biosharp 公司產品);D-氨基半乳糖(D-Gal)(Sigma 公司產品);肝功能檢測試劑盒(日立高新技術公司產品);Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒(南京凱基生物公司產品);免疫組化檢測試劑盒、辣根酶標記抗地高辛抗體(北京中杉金橋公司產品);CD123 抗體(Santa Cruz 公司產品);CD11c 抗體(Abcam 公司產品);自動生化分析儀(日立LABOSPECT003 公司產品)。

1.3 動物分組與處理 70 只大鼠分6 只正常組，其余64 只先制作免疫性肝纖維化模型，具體方法為每次取0.5ml 牛血清白蛋白乳化液(含牛血清白蛋白4mg)皮下多點注射致敏，共4 次(間隔14、10、10d)。然后采用尾靜脈注射牛血清白蛋白攻擊，每周兩次，牛血清白蛋白含量自2mg/次漸加0.5mg/次至4mg/次，維持此劑量，共6 周。到第5 周時共成模44 只，取30 只分為5 組:肝纖維化組T0、模型組T1、模型組T2、中藥組T1、中藥組T2。在第6 周時開始給予中藥組T1、T2每天灌胃茵陳蒿湯液0.4ml/100g，模型組T1、T2大鼠灌胃等量生理鹽水。第6 周末，除正常組、肝纖維化組T0外，其余4 組均予以腹腔注射D-Gal+LPS 液(合D-Gal 400mg/kg，LPS 100 μg/kg)急性攻擊建立慢加急性肝衰竭模型。中藥組T1、T2大鼠在急性攻擊后立即灌胃茵陳蒿湯液0.4ml/100g，q4h，模型組T1、2大鼠則灌胃等量生理鹽水。于急性攻擊前(正常組、肝纖維化組T0)及攻擊后1h(模型組T1、中藥組T1)、12h(模型組T2、中藥組T2)每組各取6 只大鼠處死取血，另取肝組織置4%多聚甲醛溶液內固定。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 各組大鼠肝功能檢測 采用自動生化分析儀檢測肝功能，包括ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TP、Alb、Glo、GGT、ALP。

1.4.2 各組大鼠肝臟病理學變化 肝臟大體標本經觀察照相后，取肝組織標本石蠟包埋后切片，常規HE 染色，中性樹膠，蓋玻片封片。

1.4.3 各組大鼠細胞凋亡指數 TUNEL 凋亡染色按試劑盒說明書操作，具體為切片脫臘至水后，促滲，封閉，通透，TdT 酶反應液37℃避光反應60min，鏈霉素-HRP 液37℃避光反應30min，DAB 液顯色。然后進行免疫組化染色，一抗液為CD123抗體或CD11c 抗體，加入二抗液孵育后GBI-久紅液顯色，蘇木素復染，封片。同時制作陽性片與陰性片對照。每張切片分別取10 個視野，計數CD123 或CD11c 標記的細胞數及其中的凋亡細胞數，計算凋亡指數(AI)。

1.4.4 各組大鼠肝內樹突狀細胞Axl-mRNA 表達水平 大鼠Axl 具有兩種略有差異的全序列NM_031794.1 和 NM_001013147.1，避開兩條序列的差異部分，采用Primer Premier 5.0 軟件設計探針序列:5'-CAG GGC TGA GAT TCT GAG CTG ACT GAC GAC TTT CCA-3'，地高辛標記3'端，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。先進行原位雜交染色，具體為切片脫臘至水，促滲，封閉，通透，后固定，預雜交液40°3h，雜交液40°過夜，辣根酶標記抗地高辛抗體37°60min，Streptavidin-HRP液37℃30min，DAB 液顯色。然后同上進行免疫組化染色。同時制作陽性片與陰性片對照。原位雜交切片分別取10 個視野拍照，用Adobe photoshop7.0 軟件將照片中的CD123 或CD11c標記的細胞截取出來，然后采用Image Pro Plus 6.0 軟件檢測這類細胞DAB 染色的褐色的光密度(OD)，取平均光密度值(MOD)統計。

1.5 統計學方法 所有數據采用SPSS 13.0 軟件分析完成，計量資料用均數±標準差(±s)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較，選LSD 法比較組間差異，兩組計量資料之間相關性分析采用線性相關分析，取P ＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能檢測 結果見表1、表2、表3。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT 水平比較(±s)

表1 各組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT 水平比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組T0比較，▲P ＜0.05;與對應時間點模型組比較，☆P ＜0.05;與相應T1 組比較，#P ＜0.05

表2 各組大鼠血清蛋白水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清蛋白水平比較(±s)

各組大鼠血清TP、Alb、Glo 進行比較，各組間差異無顯著性意義(TP:F=0.82，P=0.54;Alb:F=0.74，P=0.60;Glo:F=0.73，P=0.61)。這可能與模型急性攻擊后采血時間較短，而蛋白合成功能障礙尚未顯示有關性。

表3 各組大鼠血清膽紅素水平比較(±s)

表3 各組大鼠血清膽紅素水平比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組比較，▲P ＜0.05;與對應時間點模型組比較，☆P ＜0.05;與相應T1組比較，#P ＜0.05

2.2 各組大鼠病理學檢測

2.2.1 各組大鼠肝臟大體情況及HE 染色 肝纖維化大鼠肝臟色暗紅，表面有脂肪沉積，肝臟各葉黏連明顯，肝臟邊緣圓鈍，與正常組大鼠肝臟區別明顯，肝臟取材時有顆粒感，韌度高于正常組大鼠肝臟。經D-Gal +LPS 急性攻擊后，肝臟腫脹增大，切開后可見充血明顯。HE 染色顯示:肝纖維化組大鼠肝臟有脂肪變，假小葉形成;模型組大鼠則可見肝竇內淤血，大片壞死，炎性細胞浸潤，其中以12h 時間點的模型組T2明顯;中藥組炎性反應較模型組減輕。(見插頁圖1)

2.2.2 各組大鼠細胞凋亡指數 CD11c 和CD123 標記的細胞凋亡檢測表明，兩種樹突狀細胞在肝內表達均較少，每視野僅見1～31 個陽性細胞，呈分散分布，相對集中于血管周圍，CD123陽性細胞在肝內數量多于CD11c 陽性細胞。各組間兩種細胞凋亡指數的變化近似，并有顯著性意義(CD11c:F=40.40，P ＜0.01;CD123:F=43.85，P ＜0.01)。在肝纖維化組，凋亡指數已有增高，而在急性攻擊后，細胞凋亡明顯增加，且隨時間遷移凋亡細胞增加到近20%。中藥茵陳蒿湯在急性攻擊后1h、12h均顯示有抑制凋亡的作用。見表4。

表4 各組大鼠肝內樹突狀細胞凋亡指數比較(±s)

表4 各組大鼠肝內樹突狀細胞凋亡指數比較(±s)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組T0比較，▲P ＜0.05;與對應時間點模型組比較，☆P ＜0.05;與相應T1組比較，#P ＜0.05

2.2.3 各組大鼠肝內DC Axl-mRNA 表達水平 CD123+標記細胞光密度的變化幅度高于CD11c+標記細胞，但各組間兩種細胞的變化趨勢近似，在正常組細胞的Axl 表達水平較高，而隨著肝纖維化、肝衰竭的發展，Axl 表達水平下降明顯(CD11c:F=45.53，P ＜0.01;CD123:F=43.43，P ＜0.01)。顯示中藥茵陳蒿湯具有上調Axl 表達的作用。見表5。

表5 各組大鼠肝內樹突狀細胞Axl-mRNA 表達水平比較(±s，光密度)

表5 各組大鼠肝內樹突狀細胞Axl-mRNA 表達水平比較(±s，光密度)

與正常組比較，* P ＜0.05;與肝纖維化組T0比較，▲P ＜0.05;與對應時間點模型組比較，☆P ＜0.05;與相應T1組比較，#P ＜0.05

將各組CD123+細胞/CD11c+細胞凋亡指數與相應切片上Axl-mRNA 原位雜交的平均光密度進行相關性分析，發現呈線性相關。CD11c+細胞各組比較，R=0.98，R2=0.95，F=76.78，P ＜0.01。CD123+細胞各組比較，R=0.86，R2=0.73，F=10.86，P=0.03。見圖2、圖3。

圖2 CD11c +細胞凋亡指數與Axl-mRNA 表達相關性

圖3 CD123 +細胞凋亡指數與Axl-mRNA 表達相關性

3 討論

中醫認為慢加急性肝衰竭往往以黃疸為主要臨床表現，因此列入黃疸病范疇。茵陳蒿湯作為治療陽黃病的經典方劑，常作為基礎方用于ACLF 的治療。茵陳蒿湯，首載于《傷寒論》和《金匱要略》中治療陽明病瘀熱在里的發黃和谷疸。方中茵陳芳香醒脾、清熱利濕、疏利肝膽，與黃疸病病位主要在肝膽脾胃契合，歷代醫家均將其作為退黃第一要藥;梔子清泄三焦，祛除濕熱，利濕從小便而出以退黃，茵陳與梔子相伍則正體現清利濕熱從小便而出的大法;大黃推陳出新，清除瘀熱，通利大便，導熱下行為佐，大黃與梔子相伍還有涼血瀉熱的功用，對于ACLF病機中的瘀毒為患有化瘀涼血解毒之效。三藥相配，使濕熱之邪從二便排泄、濕清熱除，則黃疸可退。現代研究發現其具有保肝、利膽、抑制肝纖維化、抑制肝細胞凋亡、抗炎、鎮痛、消除氧自由基、抑制脂質過氧化等作用［1］。茵陳蒿湯治療ACLF 大鼠可明顯改善肝功能中的轉氨酶和膽紅素，在急性攻擊后12h 作用顯著，顯示了較好地保護肝細胞膜和利膽的作用。

近年來，作為免疫應答啟動器的DC 在ACLF 中的作用受到關注。肝內DC 的數量，在肝衰竭時明顯高于未發生肝衰竭時［2］。因此在發生ACLF 時，血循環中的DC 富集到肝臟，并被激活。DC 被激活后，促使機體的免疫反應及免疫修復。同時因為免疫反饋機制的作用［3］，DC 等通過凋亡等形式調控著免疫強度。在本研究中，DC 的凋亡染色顯示在ACLF 大鼠肝內，DC 細胞凋亡隨著病情的進展逐漸增加，顯示作為免疫啟動細胞的DC 在肝內的凋亡增加可能是肝內炎癥反應持續存在并逐步加重的重要因素。

在DC 凋亡的調控中，一種新的信號通道——Gas6/Axl 信號通道受到關注。生長停滯特異性基因6(growth arrest specific gene 6，Gas6)是一類新的生長因子，它的受體屬于受體酪氨酸激酶家族，包括Sky(Tyro3)、Axl、Mer，也統稱TAMreceptor。Gas6 具有抗細胞凋亡的作用，主要是通過Gas6-Axl-PI3K-Akt 起抗凋亡作用［4］。本研究表明在肝臟免疫組化和原位雜交圖像分析中，DC 的凋亡與Axl 的表達呈負相關，這表明了Axl 信號抑制DC 凋亡的作用是DC 凋亡的主要調控因素。中藥治療具有多靶點、多途徑的作用，其中免疫調控是其作用的重要方面。目前已有關于一些草藥成分調控DC 凋亡從而影響機體的免疫狀態的報道［5］，在本研究中茵陳蒿湯對DC 凋亡的下調作用與上調Axl 表達呈密切的相關性，提示該通道可能是茵陳蒿湯調控DC 凋亡，從而控制肝內免疫反應程度的主要機制，但其具體的作用靶點及上下游分子有待進一步明確。

［1］孟姝.茵陳蒿湯的藥理作用研究［J］.臨床合理用藥，2011，4(5B):152 -153.

［2］Zhang Z，Zou ZS，Fu JL，et al.Severe dendritic cell perturbation is actively involved in the pathogenesis of acute-on-chronic hepatitis B liver failure［J］.J Hepatol，2008，49(3):396 -406.

［3］Mattei F，Bracci L，Tough DF，et al.Type ⅠIFN regulate DC turnover in vivo［J］.Eur J Immunol，2009，39 (7):1807 -1818.

［4］符江琳，劉承云，徐曉，等.Gas6 經P13K/Akt 通路對缺氧復氧誘導H9c2 細胞凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(8):1508 -1512.

［5］Hu Z，Jiao Q，Ding J，et al.Berberine induces dendritic cell apoptosis and has therapeutic potential for rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2011，63 (4):949 -959.