云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因的克隆與序列分析

趙琰明，朱家穎，澤桑梓，趙 寧，楊 斌＊

（1.西南林業大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室，昆明 650224；2.云南省林業職業技術學院，昆明 650224）

生物體在生命活動過程中，特別是在逆境脅迫條件下會產生多種活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧陰離子自由基、單線態氧、過氧化氫和羥自由基等［1］。這些活性氧具有很強的氧化能力，當他們在生物體內過量積累時可造成機體蛋白質、脂質、DNA 及其他細胞組分的嚴重損傷，對生物體有很大危害［2］。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體各組織，在機體抗氧化和免疫過程中起著重要作用。它與過氧化氫酶以及過氧化物酶共同組成了保護酶系統［3］。當機體內活性氧大量積累時，SOD 就會被大量誘導生成，催化活性氧發生歧化反應，生成水和過氧化氫［4］。它是唯一能夠特異性清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶，平衡機體的氧自由基，從而起到保護機體的作用［5-6］。超氧化物歧化酶按照金屬輔基主要分為Fe-SOD、Mn-SOD 和Cu／Zn-SOD 3種，其中銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內分布相對廣泛，也是目前為止研究最多的超氧化物歧化酶［7］。已有研究表明銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內有胞內形式（icCu／Zn-SOD）和胞外形式（ec-Cu／Zn-SOD）兩種［8］。

云南切梢小蠹（Tomicusyunnanensis）是鞘翅目（Coleoptera）小蠹科（Scolytidae）切梢小蠹屬（Tomicus）嚴重為害多種松樹的次期性蛀干害蟲［9-10］。該害蟲入侵寄主后寄主會分泌樹脂以抵御其入侵，但如果云南切梢小蠹的群集足夠快速或者寄主本身長勢比較衰弱，寄主最終會由于其抵御機制耗盡而被入侵者殺死［11-12］。對于寄主的抵御反應，云南切梢小蠹也有自己的防御機制，而且是通過調控自身防御相關基因實現的。因此，對云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因進行克隆分析有助于從分子水平闡釋云南切梢小蠹在受到寄主抵御時自身的防御機制。本研究利用RACE 技術，首次克隆了云南切梢小蠹Cu／Zn-SOD cDNA 全長序列并進行初步分析，為探索在受到寄主抵御時云南切梢小蠹的自身防御機制提供一些基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

云南切梢小蠹采自云南省曲靖市沾益縣九龍山林場。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取及RT-PCR

利用Trizol試劑（Invitrogen）提取云南切梢小蠹成蟲總RNA。總RNA 經1%瓊脂糖電泳分析其質量后，用分光光度計測定其含量。然后以提取的總RNA 為模板，用SMART RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒合成RACE cDNA模板。

1.2.2 SOD 基因克隆

從已構建的云南切梢小蠹轉錄組數據庫中獲得超氧化物歧化酶基因片段序列［13］，根據其設計3′RACE 引 物（5′-GTTGGCTTGTGCTGTTATTGGACT-3′）和5′RACE引物（5′-GTACCACCTGGTTGACTGCTTCTTGCAGTA-3′），以合成的cDNA為模板克隆獲得基因的3′和5′端序列。PCR 擴增條件為：94 ℃預變性3min；94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min，40 個 循環；72 ℃延伸10 min。PCR 擴增片段經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAquick-Gel Extraction Kit（Qiagen）回收PCR 產物，用TA 克隆法連接入pGEM?-T-easy載體（Promega），藍白斑篩選，挑取陽性菌落進行克隆，由上海生工生物工程有限公司測序。然后將所得序列片段拼接得到cDNA 全長序列。

1.2.3 序列分析

利用NCBI上的open reading frame finder（ORF finder）搜索開放閱讀框，GENETYX 軟件將其翻譯成氨基酸序列，并用Motifscan分析氨基酸序列中存在的結構域。利用ClustalX 1.83進行多序列比對分析，并利用MEGA 5.0軟件構建NJ（neighborjoining）分子系統進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR

解剖云南切梢小蠹成蟲分別獲得新鮮的頭、胸、腹、足、翅，用Trizol試劑提取獲得相應部位的總RNA，并分別提取保存于-80 ℃冰箱的云南切梢小蠹幼蟲、蛹、成蟲的總RNA，然后將各樣本總RNA定量至1μg，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉錄合成cDNA 模板。根據本次克隆獲得的云南切梢小蠹SOD 基因序列設計用于熒光定量的正向引物（5′-CTGACGGAGTAGCCACGAT-3′）和反向引物（5′-ATAACAGCACAAGCCAACC-3′）；根據華山松大小蠹和中歐山松大小蠹18SRNA 基因（GenBank 登錄號分別為KJ507200和KJ531053）的保守序列設計正向引物（5′-TTCAAATGTCTGCCTTATC-3′）和反向引物（5′-GTGGTAGCCGTTTCTCA-3′）擴增獲得云南切梢小蠹18SRNA 基因片段，以作為內參基因。實時熒光定量PCR 反應體系（10μL）為：cDNA 模板1μL，上下游引物各0.5μL，iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix 5μL，雙蒸水3μL。PCR 擴增程序為95℃預變性3min；95℃變性10s，55℃退火20s，然后讀板，39個循環；最后以每5s上升0.5 ℃的速度從65～95 ℃記錄熔解曲線，每個反轉錄樣品重復3次。使用CFX96實時定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進行檢測。反應結束后，以18SRNA 為內參基因，用2-ΔΔCT 法分析云南切梢小蠹各發育階段及不同部位SOD基因的相對轉錄水平［14］。

1.2.5 數據分析

不同發育階段和不同部位的SOD 基因相對表達量數據利用SPSS軟件進行One-way ANOVA 方差分析，多重比較采用Duncan法，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 序列分析

經過測序得到云南切梢小蠹SOD cDNA 序列全長為768bp，5′端非編碼區80bp，3′端非編碼區226bp，開放閱讀框462bp。將其在GenBank中注冊，登錄號為KM278528。該基因推導的多肽序列為153個氨基酸（圖1）。其推導的氨基酸序列預測理論分子量為15.8ku，等電點為5.68。Motifscan分析顯示，該蛋白存在2個Cu／Zn-SOD 的特異序列（GFHIHEFGDNT42-52和GNAGGRLACAVI136-147），3個N-末端酰基化位點（NGTV14-17、NGSL30-33、NMTD96-99），1個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（casein kinaseⅡphosphorylation site）（TDEE73-76），4個N-端酰基化位點（N-myristoylation site）（GSLKGL31-36、GCISAG54-59、GNIQAN83-88和GNAGGR136-141），2個蛋白激酶C磷酸化位點（protein kinase C phosphorylation site）（SLK32-34和TDK98-100），第1～151氨基酸區域具有銅鋅超氧化物歧化酶超家族（copper／zinc superoxide dismutase superfamily）的保守結構域。

圖2 云南切梢小蠹與其他昆蟲SOD多序列比對Fig.2 Multiple alignment of SOD sequences fromTomicus yunnanensis and other insects

2.2 氨基酸序列相似性比對及進化樹分析

同源性比對分析發現，云南切梢小蠹SOD 基因與中歐山松大小蠹（Dendroctonusponderosae）SOD基因在氨基酸水平上相似性高達93%，與赤擬谷盜（Triboliumcastaneum）也有71%的一致性。而與半翅目的點蜂緣蝽（Riptortuspedestris）、侵擾錐獵蝽（Triatomainfestans），膜翅目的麗蠅蛹集金小蜂（Nasoniavitripennis）、佛羅里達弓背蟻（Camponotusfloridanus），鱗翅目的柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera），雙翅目的黑果蠅（Drosophilavirilis）、家蠅（Muscadomestica）氨基酸序列一致性也均在67%～71%之間。多序列比對分析表明，不同物種甚至不同目的昆蟲Cu／Zn-SOD 氨基酸序列存在多個高度保守區域。如圖2所示，Cu、Zn與6個組氨酸（His）殘基和1個天冬氨酸（Asp）配位，其中Cu原子分別與His44、His46、His61和His118配位，Zn原子分別與His61、His69、His78和Asp81配位。Cu、Zn共同連接His61組成“咪唑橋”結構。半胱氨酸Cys55和Cys144之間形成了Cu／Zn-SOD中唯一一對鏈內二硫鍵。

為了確定克隆獲得的云南切梢小蠹SOD 與其他昆蟲SOD 的系統進化關系，利用MEGA5.0將多序列比對所得結果用臨位相連法（NJ）構建系統發育樹。如圖3所示，克隆獲得的云南切梢小蠹SOD明顯區別于Mn-SOD，與其他昆蟲的Cu／Zn-SOD聚為一族，并且與icCu／Zn-SOD 聚在一起。

圖3 云南切梢小蠹及其他物種SOD的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SODs fromTomicus yunnanensis and other insects

2.3 云南切梢小蠹SOD 基因在各發育階段及不同部位的表達

由圖4可以看出云南切梢小蠹SOD 基因在不同發育階段均有表達，并且在蛹期相對表達量最高，顯著高于幼蟲期和成蟲期。圖5結果表明云南切梢小蠹SOD 基因在頭、胸、腹、足、翅各個部位均有表達。其中SOD 基因在足部表達量最高，顯著高于其他部位，在頭部也有較高表達，也明顯高于剩余3個部位。而在其胸部、腹部還有翅中的表達量相對都較低，并且在這3個部位中相對表達量差異不顯著。

圖4 云南切梢小蠹不同發育階段SOD基因的相對表達量Fig.4 The relative expression levels of SOD gene in Tomicus yunnanensis at different developmental stages

圖5 云南切梢小蠹不同部位SOD基因的相對表達量Fig.5 The relative expression levels of SOD gene in different parts of Tomicus yunnanensis

3 討論

本研究利用RACE技術，克隆獲得了云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因。該基因與其他昆蟲SOD具有很高的相似性，這體現了不同昆蟲超氧化物歧化酶在進化過程中的保守性。生物體內Cu／Zn-SOD又可分為icCu／Zn-SOD和ecCu／Zn-SOD，兩者在催化歧化反應時有著相同的速率和相似的動力學常數。ecCu／Zn-SOD在N 端存在一小段信號肽，為分泌型蛋白，主要存在于組織外基質及細胞表面；icCu／Zn-SOD沒有信號肽，主要存在于細胞質中［15］。通過在線軟件分析發現，本次所得云南切梢小蠹SOD 基因推導的氨基酸序列并無信號肽和跨膜結構域，這些完全符合ic-Cu／Zn-SOD的結構特征。經系統發育樹進一步分析表明，克隆所得的云南切梢小蠹SOD與icCu／Zn-SOD聚在一起。因此斷定本研究得到的云南切梢小蠹SOD為icCu／Zn-SOD。

超氧化物歧化酶（SOD）被稱為生物體抗氧化系統的第一道防線，其廣泛存在于生物體各個發育階段及不同的組織，在很多不同類型的細胞中均有表達［8］。云南切梢小蠹icCu／Zn-SOD 基因在其各個發育階段均有表達，并且蛹期的表達量最高，與黃粉蟲icCu／Zn-SOD在蛹期表達量最高一致，不過在黃粉蟲幼蟲中隨著齡期的增加icCu／Zn-SOD 基因的表達量也增加，最終超過成蟲［16］。意大利蜜蜂和中華蜜蜂SOD 基因在蛹期表達量最低［17-18］，與本研究結果相反，這說明不同昆蟲在不同發育階段SOD 基因的相對表達量也不同，這可能與昆蟲自身的生活習性和環境有關。本次研究發現云南切梢小蠹ic-Cu／Zn-SOD 基因在足部的表達量顯著高于頭、胸、腹、翅各部位。目前對于昆蟲足部SOD 基因表達的相關研究較少，但已有研究表明蚌類不同組織中SOD表達強度雖然不同，卻在斧足組織中表達最強，這與斧足的運動功能是相關的［19］。紫貽貝主要依靠閉殼肌實現其貝殼的開閉，是其主要的運動器官，因此其閉殼肌SOD含量較豐富［20］。云南切梢小蠹平時基本以足部爬行運動為主，極少飛行，這可能與其足部SOD基因的表達量相對較高有很大關系。

超氧化物歧化酶不僅在細胞防御活性氧機制中扮演著重要角色，同時在昆蟲、脊椎動物甚至一些水產無脊椎動物發揮先天免疫功能中也起著重要的作用［21-22］。它們能增強昆蟲對有毒化學物質、熱壓、殺蟲劑還有一些微生物侵染的抵抗力［23］，在昆蟲生長發育和抗環境脅迫過程中起著巨大作用。在黃粉蟲中，SOD 在血細胞里表達量相對較高，而在角質層和脂肪體中表達量相對較少，這可能是由于SOD參與免疫反應，而血細胞正是昆蟲免疫系統的主要組成單元［16］。生命延續和抗逆性是生物體滯育期的兩個最重要特征，研究發現超氧化物歧化酶在維持尖音庫蚊越冬期生命體征以及增強自身抗逆性中發揮著重要的作用［24］?，F在對于超氧化物歧化酶在寄主與寄生物相互作用過程中所起的作用已經有所研究。超氧化物歧化酶與由活性氧誘導的寄生蟲致死有關，另外，寄生蟲也能通過調控寄主的超氧化物歧化酶基因來滿足自己的生存［25］。

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