北京地區草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性及抗性分子機制

陳帥民，蘆 帆，張 璨，張 佳，張國珍

（中國農業大學植物病理學系，農業部植物病理學重點實驗室，北京 100193）

草莓灰霉病是草莓上常見的嚴重病害之一，主要發生在采果期。采后果實常迅速腐爛，造成非常嚴重的損失。該病害的病原菌灰葡萄孢（Botrytis cinereaPers.）還可引起花枯、侵染葉片和葉柄［1］。灰葡萄孢具有寄主范圍廣、繁殖快和遺傳變異頻繁等特點，使其易于對殺菌劑產生抗性［2］。

以異菌脲、腐霉利等為代表的二甲酰亞胺類殺菌劑是國外20 世紀70 年代開發的一類新型殺菌劑，對灰霉病具有良好防效，目前仍是生產上防治灰霉病的常用藥劑。據報道，我國部分省區的草莓灰霉病菌已經對二甲酰亞胺類殺菌劑產生了抗性。2005-2006年禮茜等［3］檢測了浙江省建德市和杭州下沙區的2個草莓主產區的草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性，發現建德下涯和廟頭張兩地的抗性頻率達17.5%。2010年胡偉群等［4］對分離自浙江杭州市售草莓的83個灰霉病菌菌株的測定結果顯示，對異菌脲的抗性頻率達到18.1%。2012 年潘以樓等［5］檢測江蘇草莓主產區的句容市和宜興市采集的草莓灰霉病菌為對異菌脲的抗性頻率為64.6%。因此，有必要繼續加強草莓灰霉病菌對該類殺菌劑抗性情況的監測。

已有研究表明，二甲酰胺類殺菌劑可能通過干擾灰葡萄孢的滲透壓傳導途徑來抑制其生長，而灰葡萄孢對二甲酰胺類殺菌劑的抗性產生可能與編碼組氨酸激酶基因（BcOS1）的突變有關，BcOS1具有調節滲透壓的功能［6］。Oshima等［7］對日本（主要是大阪）的灰葡萄菌株對二甲酰胺類殺菌劑的抗性研究發現有3種突變類型，類型Ⅰ：第365位氨基酸由異亮氨酸變為絲氨酸；類型Ⅱ：有3個突變位點，分別為第368位由纈氨酸變成苯丙氨酸，第369位由谷氨酰胺變為組氨酸，第447位由蘇氨酸變為絲氨酸；類型Ⅲ：有2個突變位點，分別為第369位由谷氨酸變為脯氨酸，第373位由天冬酰胺變為絲氨酸，在24個抗性菌株中突變類型Ⅰ占50%。Cui等［8］主要檢測了來自新西蘭的抗二甲酰胺類殺菌劑的灰葡萄菌株的突變情況，分為4 種類型：類型Ⅰ：第365位氨基酸由異亮氨酸變為絲氨酸；類型Ⅱ：第365位氨基酸由異亮氨酸變為天冬酰胺；類型Ⅲ：第365位氨基酸由異亮氨酸變為精氨酸；類型Ⅳ：第365位氨基酸由異亮氨酸變為絲氨酸，第369 位谷氨酰胺變為脯氨酸。李茜等［3］對采自浙江省建德市和杭州下沙區的灰葡萄孢抗藥性菌株檢測發現有兩種突變類型：第365位氨基酸由異亮氨酸變為絲氨酸；第369位由谷氨酸變為脯氨酸，第373位由天冬酰胺變為絲氨酸。

近些年，以日光溫室為主的設施草莓種植在北京地區迅速發展，種植面積持續增長，2012 年種植面積達到800hm2，總產量為1.5萬t［9］。設施栽培也為灰霉病的發生提供了有利條件。目前尚未見北京地區草莓灰霉病菌對二甲酰亞胺類殺菌劑的抗性報道。我們在檢測草莓灰霉病菌對該類殺菌劑的抗性時發現，采自北京地區各草莓園的灰霉病菌對異菌脲和腐霉利的抗性頻率完全相同（結果未列出），表明草莓灰霉病菌對這兩種殺菌劑存在交互抗性。本研究重點檢測了2013-2014年北京地區15個草莓園的草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性情況，分析了兩個年度間菌株的抗性頻率變化，并對抗性菌株的抗性分子機制進行了研究，旨在為異菌脲的合理使用和有效防治草莓灰霉病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

草莓灰霉病菌（Botrytiscinerea）：2013 年 和2014年從北京4個區15個草莓種植園采集草莓灰霉病病果，帶回實驗室進行分離培養和純化，每個病果只保留1個單孢菌株，共獲得121株單孢菌株，其中2013年57株，2014年64株（表1）。

表1 2013-2014年北京地區采集草莓灰霉病菌供試菌株信息Table 1 Tested isolates of Botrytis cinerea collected from 15strawberry gardens in Beijing from 2013to 2014

1.2 供試殺菌劑

98%異菌脲原藥由北京中植科華農業技術有限公司提供，4 ℃冰箱保存。

1.3 培養基

PDA 培養基：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，蒸餾水1 000mL。

1.4 草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性檢測

采用最低抑制濃度法（MIC）檢測供試菌株對異菌脲的抗性，鑒別濃度為5μg／mL［10］，每個菌株重復3次。

含藥培養基平板的制備：將異菌脲原藥用丙酮配制成5mg／mL溶液，吸取300μL藥液與300mL PDA 培養基混勻，倒入滅菌培養皿（d＝6cm），制成異菌脲濃度為5μg／mL的含藥平板培養基，并以添加等量丙酮的PDA 培養基為對照。

抗藥性的判別：在培養3d 的灰霉病菌菌落上，用直徑5mm 的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種在含藥培養基中央，于20 ℃培養箱黑暗培養。將在鑒別濃度培養基上不能生長或幾乎不能生長的菌株定為敏感菌株，能在鑒別濃度培養基上生長的判定為抗性菌株。

按下列公式計算各采樣點菌株的抗性頻率（resistance frequency）：

1.5 草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性水平測定

采用菌絲生長速率法［11］，對經鑒別濃度確定的抗性和敏感菌株進行EC50的測定，通過比較抗性菌株的EC50與敏感基線的比值，確定各菌株的抗性水平。抗性菌株所用含藥濃度梯度為0.2、0.5、1.0、2.5和5μg／mL，以添加等量溶劑丙酮的PDA 培養基為對照。在供試菌株菌落邊緣的同心環上用直徑5mm 打孔器打取菌餅，接種于含藥PDA 平板上，每個濃度重復3皿，置于20 ℃培養箱黑暗培養，3d后測量各處理的菌落直徑，根據以下公式計算菌絲生長抑制率：

將生長抑制率數據轉換成幾率值（Y）、藥劑濃度（μg／mL）轉換成以10為底的對數值（X），在Microsoft Excel中做回歸直線，求出毒力回歸方程（Y＝A＋BX）和相關系數，計算出藥劑對供試菌株菌絲生長抑制的有效中濃度（EC50）。當EC50與敏感基線EC50的比值小于5 時為低抗菌株，比值大于10 為高抗菌株，介于兩者之間為中抗菌株［3］。

1.6 抗異菌脲菌株的分子檢測

采用CTAB 法［12］提取供試菌株的基因組DNA，根據禮茜等［3］設計的引物對目標片段進行擴增。擴增片段為組氨酸激酶基因BcOS1N-端氨基酸重復區中已知的與二甲酰亞胺抗性相關的區段，大小為500bp 左右。引物BcHKF：5′-TCCGAGAAATTGCTTCCGTC-3′；BcHKR：5′-CCATTCACATTTTCGGTGAGG-3′。PCR擴增體系50μL：10×PCR緩沖液5.0μL，2mmol／L dNTP 4.0μL，10mol／L引物各1.0 μL，2.5U／μLTaqDNA 聚合酶0.5μL，10ng／μL模板DNA 1.0μL，ddH2O 37.5μL。PCR 擴增程序：94 ℃2min；94 ℃45s，55 ℃45s，72 ℃50s，30個循環；最后72 ℃延伸10min。

擴增產物由北京三博遠志生物技術有限公司測序，測序結果用DNAMAN 軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性

2.1.1 各區草莓灰霉病菌對異菌脲抗性頻率在年度間的變化情況

從各區菌株對異菌脲的抗性情況來看，4 個區的菌株抗性頻率明顯不同，房山區菌株的抗性頻率最高，在73.7%以上，其次是通州區和昌平區，海淀區菌株的抗性頻率最低，只有9.1%。從年度間總體平均抗性頻率變化來看，2013年菌株對異菌脲的抗性頻率為9.1%～73.7%，平均為40.4%，2014年菌株的抗性頻率為0～78.6%，平均為45.3%，較2013年增加了近5%（圖1）。

圖1 北京市4個區草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率在2013-2014年度間變化Fig.1 Changes of iprodione-resistant frequency in Botrytis cinereaisolates from strawberry collected from four districts in Beijing between 2013and 2014

2.1.2 不同草莓園灰霉病菌菌株對異菌脲的抗性頻率比較

2013年和2014 年共從15 個草莓園采集了121株草莓灰霉病菌株，各草莓園菌株的抗性表現出很大差異，抗性頻率從0 至85%不等。來自昌平區興壽、香屯和萬德園、海淀區御香園和蘇家坨的菌株對異菌脲均敏感，未發現抗性菌株。來自北京農林科學院林果所和昌平區豆豆草莓園菌株的抗性頻率低，為8.3%～12.5%。而通州區王莊和大運河、房山區長陽和夏場的菌株抗性頻率均高于60%。其他草莓園菌株的抗性頻率介于25%～50%之間（表2）。

表2 不同草莓園灰霉病菌菌株對異菌脲的抗性頻率比較Table 2 Iprodione-resistant frequency of Botrytis cinereaisolates collected from different strawberry gardens

2.2 草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性水平

本研究利用最低抑制濃度法，從2014年的64個菌株中檢測出29株對異菌脲具有抗性的菌株，經測定異菌脲對這些抗性菌株的EC50分布在0.54～3.37μg／mL之間。參照禮茜等［3］建立的灰霉病菌對異菌脲敏感基線值（EC50為0.229 9μg／mL），對抗性菌株的抗性水平進行劃分，在29個抗性菌株中，有6株為低抗菌株，18株為中抗菌株，5株為高抗菌株，分別占抗性菌株的21%、62%和17%（圖2）。低抗、中抗和高抗菌株占檢測菌株數的百分率分別為9.4%、28.1%和7.8%。表明絕大部分抗性菌株對異菌脲具有中抗至高抗水平，而且中抗水平以上菌株占菌株數的近36%。

圖2 草莓灰霉病菌29個抗異菌脲菌株的EC50分布Fig.2 Distribution of EC50value among 29 iprodione-resistant isolates of Botrytiscinereafrom strawberry

2.3 菌株抗異菌脲的分子機制

選取2個敏感菌株和6個EC50不同的抗性菌株（表3），擴增了其BcOS1基因，得到約為500bp的條帶。將所測序列與GenBank中Botryotiniafuckeli-anaBcOS1基因序列（登錄號AF396827.2）比較。結果表明，敏感菌株BcOS1基因的核苷酸序列與比對序列的相似性為100%，而抗性菌株BcOS1基因在1 214位點的核苷酸序列發生了2種類型的突變，導致對應的編碼的第365位氨基酸發生變化。在檢測的6個菌株中，Ⅰ類有4個菌株，EC50為1.37～2.39μg／mL，屬于中抗至高抗菌株，其核苷酸序列的第1 214位由ATC 變為AGC，導致第365 位氨基酸由異亮氨酸（Ile）變為絲氨酸（Ser）；Ⅱ類有2個菌株，EC50為0.54～0.64μg／mL，屬于低抗菌株，其核苷酸序列的第1 214位由ATC 變為AAC，導致第365位氨基酸由異亮氨酸變為天冬酰胺（Asn）。此外，還發現抗性菌株中第1 203位、1 347位和1 350位核苷酸也發生了變化，但對應的氨基酸并沒有改變（表3）。

3 討論

本研究檢測了2013 年和2014 年北京地區15個種植園草莓灰霉病菌對殺菌劑異菌脲的抗性情況，雖然2014年較2013年的抗性頻率沒有顯著上升，但總體的抗性頻率較高，平均為45.3%。在檢測的15個草莓園中，有4個園的抗性菌株頻率表現很高，為62.5%～87.5%。檢測出的異菌脲抗性頻率的高低與異菌脲的施用水平有關，調查發現，沒有檢測到抗性菌株或抗性菌株頻率很低的草莓園，部分是有機草莓生產園，不施或很少用殺菌劑，或是以農業防治措施為主的草莓園。當然，由于各草莓園采集的菌株數量不等或菌株數量有限，不能完全排除有漏檢抗性菌株的可能性。

表3 草莓灰霉病菌抗性菌株與敏感菌株BcOS1基因核苷酸序列及編碼氨基酸的差異比較Table 3 Comparison of BcOS1gene nucleotide and amino acid sequences between iprodione-resistant and iprodione-sensitive isolates of Botrytiscinereafrom strawberry

本研究采用最低抑制濃度法從2014年采集的64個草莓灰霉病菌菌株中檢測出了29個抗異菌脲的菌株。由于異菌脲使用較普遍，無法采集到不施用該殺菌劑的菌株建立敏感基線，本研究是參照禮茜等［3］的敏感基線值對抗性菌株的抗性水平進行劃分的。2014年采集的菌株中，屬于中抗和高抗的菌株占了近36%。異菌脲和腐霉利同屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，據我們前期的檢測結果，草莓灰霉病菌對這兩種殺菌劑存在明顯的交互抗性（結果未列出），也鑒于有些草莓園的灰霉病菌菌株對異菌脲的抗性頻率已達較高水平，因此在北京地區防治草莓灰霉病，尤其是施藥水平高的草莓園，應該限制這類殺菌劑的使用或減少使用次數，建議優先選用其他作用機制或類型的新型殺菌劑，如氟啶胺、環酰菌胺、咯菌腈等，與之輪換使用。

本研究通過抗異菌脲菌株與敏感菌株BcOS1基因的核苷酸序列的對比分析，發現北京地區草莓灰霉病菌抗異菌脲菌株有2種突變類型，以第Ⅰ類為主，即該基因核苷酸序列的第1 214位由ATC 變為AGC，導致第365位氨基酸由異亮氨酸（Ile）變為絲氨酸（Ser），這在禮茜等［3］、Oshima等［7］、Cui等［8］的研究中均有報道，而第Ⅱ類僅在Cui等［8］的報道中出現。此外，本研究還發現第Ⅰ類突變菌株的抗性水平屬于中抗和高抗，而發生第Ⅱ類突變的菌株屬于低抗菌株。由于本研究只對少部分抗性菌株的BcOS1基因進行了檢測，北京地區草莓灰霉菌的抗性菌株是否還存在其他突變類型，以及菌株的不同突變類型與抗藥性水平是否存在一定關系，還有待進一步研究。

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