基于環介導等溫擴增技術檢測瓜類細菌性果斑病菌

趙玉強，田艷麗，羅金燕，姚紅梅，余 慧，陳 磊，胡白石＊

（1.上海市農業技術推廣服務中心，上海 201103；2.南京農業大學植物保護學院，農作物生物災害綜合治理教育部重點實驗室，南京 210095）

瓜類細菌性果斑?。╞acterial fruit blotch，BFB）是西甜瓜等葫蘆科作物上重要的細菌病害，由西瓜嗜酸菌（Acidovoraxcitrulli）引起［1-2］。該病為典型的種傳病害，其病原菌可侵染葉片、果實和種子，嚴重影響果實的品質和產量，對瓜類生產及相關產業構成了極大的威脅［3］。瓜類細菌性果斑病自20世紀90 年代在我國首次報道以來，在新疆、海南、內蒙古、寧夏、北京、河北、山東、吉林、福建、湖南等地相繼發生，并呈上升趨勢，造成大田西瓜和甜瓜減產甚至絕收，給西甜瓜生產帶來巨大損失［4-9］。在病害發病初期快速、準確鑒定出BFB，及時實施有效的藥劑防控措施，對防治該病害的擴散和蔓延尤為重要。因此，建立西瓜嗜酸菌的快速、準確、便捷的檢測技術是防止該病害發生的重要舉措。

目前檢測西瓜嗜酸菌的主要方法有：傳統的細菌學分離方法［10］、Biolog鑒定方法［11］、血清學檢測方法［12］和分子生物學方法［13-16］，但這些診斷方法存在診斷過程繁瑣、周期長、成本高、靈敏度不高或特異性不強等特點，同時還需要昂貴的儀器和試劑等。2000年Notomi等人［17］報道了一種新型核酸擴增技術—環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），該方法根據目的基因及其特點，針對靶序列的6個特異性區域設計兩對引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶（BstDNA polymerase），在等溫條件下（60～65 ℃）保溫30～60min，即可實現核酸的大量擴增，并且伴有肉眼可見的副產物白色焦磷酸酶沉淀產生［17］。該檢測方法具有特異性好、靈敏度高、反應時間短、操作方便和不需要昂貴的儀器等優點，目前已被廣泛應用于病毒、細菌、原生動物和真菌等領域的檢測中［18-21］。

本試驗根據A.citrulli基因組中Aave＿4063和Aave＿4064序列的特點，基于LAMP技術建立了瓜類細菌性果斑病菌的快速恒溫擴增檢測體系，并將其應用于市售的瓜種子實際樣品檢測中。

1 材料與方法

1.1 材料

BstDNA 聚合酶購自New England Biolabs（NEB）公司；甜菜堿、MgSO4、鈣黃綠素（calcein）購自Sigma公司；dNTPs、DL100marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；Loopamp 反應管購自日本榮研化學株式會社；移液管購自AXYGEN 公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）購自上海森信實驗儀器有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒（天根細菌基因組DNA 小量制備試劑盒）購自天根（北京）公司。供試菌株寄主、來源及數量見2.2小節。

1.2 引物設計

根據Aave＿4063和Aave＿4064序列，應用Bioedit軟件進行序列分析，并使用PrimerExplore v 4軟件，依據LAMP引物的設計原則，設計LAMP引物。探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，用ddH2O 溶解后分裝，-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 LAMP反應體系的建立

LAMP檢測反應體系為25μL，包括2.5μL 10×ThermoPol［200mmol／L Tris-HCl，100 mmol／L KCl，100mmol／L（NH4）2SO4，2 mmol／L MgSO4，0.1% Trition X-100，pH 8.8］、8mmol／L MgSO4、0.8 mol／L 甜菜堿、500μmol／L each dNTP、0.4 μmol／L外引物Ac-F3 和Ac-B3、1.6μmol／L 的內引物Ac-FIP 和Ac-BIP、1μLBstDNA 聚合酶（8 U／μL）、1μL 0.02 mmol／L 鈣黃綠素染料，1μL DNA 模板或菌懸液，加ddH2O 補至25μL。將反應管置于水浴鍋65 ℃恒溫反應60min，然后80 ℃加熱5min使酶失活終止反應。

1.4 LAMP擴增產物判斷方法

LAMP擴增產物可通過肉眼觀察渾濁度的變化來判斷，也可通過加入熒光染料觀察顏色變化來判斷。本試驗在反應前加入1μL 0.02mmol／L 的鈣黃綠素染料，產生擴增的反應管顏色由橙色變為亮綠色，未產生擴增的則仍保持橙色不變，陰性對照也為橙色。

1.5 LAMP特異性檢測

按照天根細菌基因組DNA 小量制備試劑盒說明書，分別提取供試菌株的基因組DNA，進行LAMP擴增，鑒定LAMP反應的特異性。

1.6 LAMP靈敏度檢測

果斑病菌菌株xjl12的基因組DNA模板經測定濃度后，按10倍梯度稀釋為2.0×106～2.0×100cfu／mL。分別取1μL作為LAMP反應模板，每個梯度3個重復。反應結束后，鑒別是否發生了LAMP擴增，確定LAMP的靈敏度，并與常規PCR［22］的靈敏度進行比較。

1.7 實際樣品檢測

選取6種市售種子進行檢測。每份種子取300粒，剖開后，加50mL 無菌水室溫浸泡4h，將浸出液6 000r／min離心3min，棄上清。加入2mL 無菌水重新懸浮沉淀，取0.5 mL 懸浮液用于分離培養，剩余的1.5mL懸浮液利用天根細菌DNA 提取試劑盒提取DNA，取1μL DNA 作為LAMP 檢測的模板。

在進行實際樣品檢測時，所有的樣品均利用果斑病菌半選擇性培養基TWZ（0.5% 蛋白胨，0.025%CaCl2，1%吐溫-80，50 mg／L 小檗堿，50 mg／L放線菌酮，50mg／L TTC）進行分離培養，培養條件為28 ℃，24～48h，用以驗證LAMP檢測結果的可靠性。

2 結果與分析

2.1 LAMP檢測的特異性引物

本試驗所選取的靶標基因為Aave＿4063和Aave＿4064，基因序列信息均來自于GenBank（登錄號為NC＿008752：4516230～4516461）。筆者將缺失的Aave＿4063和Aave＿4064 基因中的一段（區域：4516230-4516461）核酸序列在NCBI 中進行BLASTn 和tBLASTx 搜索，結果發現沒有任何已知序列與其相同。本研究根據Aave＿4063和Aave＿4064基因序列設計了1 套果斑病菌LAMP檢測的特異性引物（表1）。其中Ac-F3／Ac-B3為外引物，Ac-FIP／Ac-BIP為內引物。

2.2 LAMP檢測方法的特異性

以本研究設計的特異性引物對果斑病菌進行LAMP擴增，以水作為陰性對照，并用其他嗜酸菌屬菌懸液作為病原菌對照檢測LAMP 反應的特異性。結果如圖1所示，果斑病菌反應管呈亮綠色，為陽性，其他嗜酸菌和陰性對照均為黃綠色，為陰性。同樣的，利用本試驗所建立的LAMP 體系，其他參試菌株也均為陰性（表2）。

表1 LAMP引物序列Table 1 The primers used for loop-mediated isothermal amplification

圖1 LAMP反應的特異性Fig.1 Specificity of LAMP detection

表2 供試細菌菌株LAMP結果1）Table 2 LAMP results of tested strains

2.3 LAMP檢測方法的靈敏度

將10倍梯度稀釋的果斑病菌懸液進行LAMP擴增。結果如圖2～3所示，檢測結果的最低檢測靈敏度為2.0×101cfu／mL，比常規PCR檢測方法高100倍。

2.4 實際樣品檢測結果

利用本試驗建立的瓜類細菌性果斑病菌LAMP檢測體系，對市售的西、甜瓜種子進行了檢測。結果如圖4 所示：1～5 反應管呈亮綠色，為陽性，6～7反應管呈現黃綠色，為陰性，且所有LAMP檢測結果與半選擇性培養基結果一致（結果未列出）。結果表明本研究所建立的檢測方法可用于實際樣品的檢測。

圖2 LAMP反應的靈敏度Fig.2 Sensitivity of LAMP method using serially diluted Acidovorax citrulli as template

圖3 常規PCR 檢測的靈敏度Fig.3 Sensitivity of conventional PCR using serially diluted Acidovorax citrulli as template

圖4 利用LAMP體系從西、甜瓜種子中檢測西瓜嗜酸菌Fig.4 Detection of Acidovorax citrulli in cantaloupe and watermelon seed samples using LAMP

3 討論

西瓜嗜酸菌引起的瓜類細菌性果斑病為種傳病害，種子帶菌是其發生的主要原因［23］。近期研究表明，在溫室育苗的條件下，單粒種子僅攜帶10cfu的西瓜嗜酸菌就可以導致瓜類細菌性果斑病的大面積發生和流行［24］。至今對該病害還沒有有效的防治措施，加強檢疫，控制其傳播擴散是預防此病害最有效的措施。目前，WFB1／WFB2是西瓜嗜酸菌PCR檢測常用的引物之一，由于西瓜嗜酸菌與燕麥嗜酸菌（A.avenae，GenBank：NC＿015138）親緣關系非常接近，所以常常導致檢測引物無法區分這兩個種［22］。而本試驗通過生物信息學分析選取的靶標基因為Aave＿4063和Aave＿4064，將Aave＿4064序列在NCBI中進行BLASTn和tBLASTx比對，結果沒有任何已知序列與其相同，在燕麥嗜酸菌基因組中也未發現其同源序列，從而保證了檢測的特異性。利用本文建立基于LAMP 的西瓜嗜酸菌檢測體系，對不同寄主上分離到的西瓜嗜酸菌菌株和其他17個參試菌株進行檢測，結果表明，該體系能特異地擴增出西瓜嗜酸菌，能有效區分開與其親緣關系較近的菌株，例如燕麥嗜酸菌（A.avenae）、卡特萊蘭嗜酸菌（A.cattleyae）、敏捷嗜酸菌（A.facilis）、魔芋嗜酸菌（A.konjaci）及假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌。證明本研究所設計的LAMP 檢測引物種內保守、種間特異。在靈敏度試驗中，常規PCR 的檢測靈敏度為2.0×103cfu／mL，而該體系的最低檢測靈敏度為2.0×101cfu／mL，比常規PCR的靈敏度高出100倍。

本研究建立的LAMP 檢測體系在等溫條件下（65 ℃）就能進行擴增反應，同時反應時間短，僅需1h，不需要熱循環儀，一個普通水浴鍋就可進行，這是常規的PCR 檢測不能達到的。在結果判定時，本研究采用加入熒光染料鈣黃綠素，產生擴增的反應管顏色由橙色變為亮綠色，未產生擴增的則保持橙色不變，該方法既提高了對檢測結果的肉眼識別率，又可直接用于瓜類細菌性果斑病的現場診斷，大大提高了檢測效率。在利用本研究建立的LAMP檢測體系從瓜種子中檢測西瓜嗜酸菌時，包括種子處理的時間在內，共需8h。一般來說，利用半選擇性培養基進行病原菌分離和幼苗生長測定法是西、甜瓜種子帶菌檢測的常用方法，一般需要3～8d。所以本研究建立的檢測體系與常規方法相比省時、省力、省錢。

LAMP技術在實際應用中表現出特異性強、靈敏度高、速度快、操作方便等特點，為檢疫性有害生物檢測提供了有力的技術支持，對早期檢疫性有害生物準確診斷具有重要意義。本研究首次建立了對西瓜嗜酸菌檢測的可視化LAMP方法，該方法簡單易行，對儀器設備和檢測人員的技能要求不是十分苛刻，其特異性、靈敏度及快速檢測方面均能夠滿足口岸檢疫和農業生產單位對檢疫性有害生物的快速診斷需要，可推廣應用于西、甜瓜種苗的健康檢測中。

［1］Schaad N W，Postnikova E，Sechler A，et al.Reclassification of subspecies ofAcidovoraxavenaeasA.avenae（Manns 1905）emend.，A.cattleyae（Pavarino，1911）comb.nov.，A.citrulli（Schaad et al.，1978）comb.nov.，and proposal ofA.oryzaesp.nov.［J］.Systematic and Applied Microbiology，2008，31（6-8）：434-446.

［2］Willems A，Goor M，Thielemans S，et al.Transfer of several phytopathogenicPseudomonasspecies toAcidovoraxasAcidovoraxavenaesubsp.avenaesubsp.nov.，comb.nov.，Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，Acidovoraxavenaesubsp.cattleyae，andAcidovoraxkonjaci［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1992，42（1）：107-119.

［3］Walcott R R，Gitaitis R D，Castro A C.Role of blossoms in watermelon seed infestation byAcidovoraxavenaesubsp.citrulli［J］.Phytopathology，2003，93（5）：528-534.

［4］蔡學清，黃月英，楊建珍，等.福建省西瓜細菌性果斑病的病原鑒定［J］.福建農林大學學報，2005，34（4）：434-437.

［5］薛莉，楊成德，陳秀蓉，等.甘肅省西瓜細菌性果斑病的診斷［J］.植物保護，2009，35（2）：53-57.

［6］任小平，李小妮，王琳，等.廣東西瓜果斑病的病原鑒定［J］.華南農業大學學報，2010，31（4）：40-43.

［7］胡俊，黃俊霞，劉雙平，等.內蒙古哈密瓜細菌性果斑病的發生特點與防治技術［J］.中國植保導刊，2006，26（12）：19-20.

［8］趙廷昌，趙洪海，王懷松.山東省西瓜、甜瓜發生瓜類細菌性果斑病［J］.植物保護，2009，35（5）：170-171.

［9］金巖，張俊杰，吳燕華，等.西瓜細菌性果斑病的發生與病原菌鑒定［J］.吉林農業大學學報，2004，26（3）：263-266.

［10］趙廷昌，孫福在，王冰萬，等.哈密瓜細菌性果斑病病原菌鑒定［J］.植物病理學報，2001，31（4）：357-364.

［11］許志剛，李斌，胡白石.我國甜瓜和西瓜上一種新細菌病害的病原及寄主范圍測定［C］∥2003華東植物病理學術研討會暨江蘇省植物病理學會第十次會員代表大會論文集，2003：86-90.

［12］回文廣，趙廷昌，孫福在，等.哈密瓜果斑病菌血清學快速檢測［C］∥中國植物病理學會2004年學術年會論文集，2004：172.

［13］Ha Y，Fessehaie A，Ling K S，et al.Simultaneous detection ofAcidovoraxavenaesubsp.citrulliandDidymellabryoniaein cucurbit seedlots using magnetic capture hybridization and realtime polymerase chain reaction［J］.Phytopathology，2009，99（6）：666-678.

［14］Schaad N W，Song W Y，Hatziloukas E.PCR primers for detection of plant pathogenic species and subspecies ofAcidovorax：US，6146834［P／OL］.2000-11-14.http：／／patft.uspto.gov／netacgi／nph-Parser？Sect2＝PTO1＆Sect2＝HITOFF＆p＝1＆u＝／netahtml／PTO／search-bool.html＆r ＝1＆f＝G＆l＝50＆d ＝PALL＆RefSrch＝yes＆Query＝PN／6146834.

［15］Bahar O，Efrat M，Hadar E，et al.New subspecies-specific polymerase chain reaction-based assay for the detection ofAcidovoraxavenaesubsp.citrulli［J］.Plant Pathology，2008，57（4）：754-763.

［16］Tian Yanli，Zhao Yuqiang，Bai Sa，et al.Reliable and sensitive detection ofAcidovoraxcitrulliin cucurbit seed using apadlock probe-based assay［J］.Plant Disease，2013，97（7）：961-966.

［17］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63.

［18］Endo S，Komori T，Ricci G，et al.Detection ofgp43ofParacoccidioidesbrasiliensisby the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method［J］.FEMS Microbiology Letters，2004，234（1）：93-97.

［19］Okafuji T，Yoshida N，Fujino M，et al.Rapid diagnostic method for detection of mumps virus genome by loop-mediated isothermal amplification［J］.Journal of Clinical Microbiology，2005，43（4）：1625-1631.

［20］Dai Tingting，Lu Chenchen，Lu Jing，et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for detection ofPhytophthorasojae［J］.FEMS Microbiology Letters，2012，334（1）：27-34.

［21］戴婷婷，陸辰晨，沈浩，等.基于環介導等溫擴增技術檢測橡樹疫霉菌［J］.南京農業大學學報，2013，36（3）：23-28.

［22］Walcott R R，Langston D B，Sanders F H J，et al.Investigating intraspecific variation ofAcidovoraxavenaesubsp.citrulliusing DNA fingerprinting and whole cell fatty acid analysis［J］.Phytopathology，2000，90（2）：191-196.

［23］Hopkins D L，Thompson C M.Seed transmission ofAcidovoraxavenaesubsp.citrulliin cucurbits［J］.Hortscience，2002，37（6）：924-926.

［24］Dutta B，Scherm H，Gitaitis R D，et al.Acidovoraxcitrulliseed inoculum load affects seedling transmission and spread of bacterial fruit blotch of watermelon under greenhouse conditions［J］.Plant Disease，2012，96（5）：705-711.