甘藍根腫病的人工接種體系與抗源材料篩選

陳 欣，王 超，張曉烜，王 帥

（東北農業大學園藝學院，哈爾濱 150030）

甘藍根腫病，是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin）侵染引起的一種世界性土傳病害，該病原菌除侵染甘藍外，還可侵染其他十字花科蔬菜引起根腫病。受侵染的甘藍表現為根部組織異常增生、腫大，植株地上部發育遲緩，不能形成正常的葉球，嚴重減產甚至絕收［1］。由于根腫病為土傳病害，其病菌休眠孢子在無感病寄主的土壤中可存活20年之久，土壤一旦污染，將不再適宜十字花科蔬菜的栽培［2］。國內外的研究和實踐證明，防治該病害的最根本途徑是選育抗病品種，而建立一套穩定的人工接種體系是抗病育種的基礎。目前國內外對甘藍根腫病最佳人工接種體系仍無定論，為此，本研究在參考已報道的十字花科蔬菜根腫病的各種接種方法和條件的基礎上，對比了不同接種方法，不同接種濃度以及不同土壤pH 條件對甘藍根腫病接種效果的影響，篩選出適合甘藍根腫病接種的最佳組合，從而建立一套穩定的甘藍根腫病接種體系，并利用此接種體系，對東北農業大學甘藍課題組提供的20份甘藍材料進行了抗性鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：在東北農業大學農場基地甘藍根腫病發病田塊采集發病植株腫根和菌土，-20℃冷凍保存。

供試甘藍材料：高度感病品種‘京豐一號’［3］；由東北農業大學園藝學院甘藍課題組提供的20個自交系：‘PM’、‘PF’、‘P1’、‘P2’、‘P3’、‘P4’、‘R’、‘Q1’、‘Q2’、‘Q3’、‘3-1003’、‘3-1004’、‘3-1005’、‘3-1006’、‘3-1009’、‘3-1012’、‘3-1015’、‘3-1017’、‘3-1020’、‘3-1021’。

1.2 方法

1.2.1 病田土壤含菌量的測定

為了解根腫菌的致病濃度，從而確定有效的接種濃度，對發病田塊土壤中病原菌休眠孢子含量進行統計，方法如下：在發病田塊共確定20個樣點（按不同品種設點取樣），由于根腫菌休眠孢子活動較為集中，在土層10cm 處含量較多［4］，因此取樣時在每個取樣點的病株根部周圍距地表10cm 處取500g土壤，采用楊佩文的蔗糖溶液離心法分離菌土中的休眠孢子［5］，利用血球計數板計測休眠孢子濃度，并計算20個樣點土壤含菌量的平均值，以此作為后續試驗接種濃度的參考指標。

1.2.2 接種液的制備

取出部分冷凍保存的甘藍腫根，室溫解凍，剪成小塊后稱重，加等量無菌水，用組織搗碎勻漿機攪成勻漿后4層紗布過濾，4 000r／min 離心15min，棄上清液；用無菌水懸浮沉淀，3 500r／min 離心10 min，棄上清液，重復此步3次，最后棄上清液，重新用無菌水懸浮沉淀，制成根腫菌休眠孢子懸浮液，利用血球計數板計測休眠孢子懸浮液濃度，并調至1.6×108個／mL（參考發病田塊土壤含菌量的平均值）。4 ℃保存備用。

1.2.3 不同接種方法對甘藍根腫病接種效果的影響

蘸根法［6］：將消毒的‘京豐一號’種子播種在裝有滅菌基質（蛭石∶草炭∶滅菌土＝1∶1∶2）的營養缽（直徑×高度＝9cm×9cm）中，培養10d后拔出無病蟲幼苗，將其根部洗凈并用吸水紙吸干，然后將根部浸入配制好的1.6×108個／mL休眠孢子懸浮液中，4h后將幼苗重新移植到營養缽中培養，正常管理。

根際土壤注菌法［7］：將消毒后的‘京豐一號’種子播在裝有滅菌基質的營養缽中，用移液槍吸取2 mL配制好的1.6×108個／mL 休眠孢子懸浮液注射于根際基質，正常管理。

菌土法［8-9］：將冷凍保存的甘藍腫根取出，室溫解凍，剪成小塊后稱重，加等量無菌水，用組織搗碎勻漿機攪成勻漿后，與滅菌基質混勻，采用楊佩文的蔗糖溶液離心法分離菌土中的休眠孢子［5］，利用血球計數板計測休眠孢子濃度，最終使混勻后的菌土中休眠孢子濃度達1.6×108個／g基質，在25 ℃黑暗條件下保濕48h，然后在裝有滅菌基質的培養缽中挖一圓柱形小洞（直徑30 mm，高35 mm），將混合好的菌土撒入其中，然后將消毒后的‘京豐一號’種子播入，正常管理。

以上各處理分別接種幼苗30 株，對照為同苗齡期未做接種處理的‘京豐一號’植株，3次重復，在25 ℃條件下培養，保持基質濕潤，6 周后調查發病情況。

1.2.4 不同接種濃度對甘藍根腫病接種效果的影響

采用菌土法接種，稱取一定量的甘藍腫根，加等量水后，用組織搗碎勻漿機攪成勻漿后與定量的滅菌基質混勻制成6種不同濃度的菌土，各處理濃度為：每克滅菌基質中分別拌入0.002、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4g腫根，統計6種不同濃度的菌土中的病菌孢子含量，采用楊佩文的蔗糖溶液離心法分離菌土中的孢子［5］，利用血球計數板計算濃度。分別對‘京豐一號’，‘PM’，‘P3’，‘3-1012’進行接種，每種供試甘藍材料的每個接種濃度重復3次，每次重復接種30株，以同苗齡期未做接種處理的‘京豐一號’植株為對照，在25 ℃條件下培養，保持基質濕潤，6周后調查發病情況。

1.2.5 不同土壤pH 條件對甘藍根腫病接種效果的影響

采用菌土法接種，選擇1.2.4試驗篩選得到的最佳接種濃度（1.6×108個／g基質）配制菌土，用硫酸亞鐵溶液和石灰水分別調節菌土pH 至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0等6種不同pH，每個處理各接種‘京豐一號’30株，以不經處理的菌土作對照，3次重復，在25℃條件下培養，保持基質濕潤，6周后調查發病情況。

1.2.6 室內人工接種法對供試甘藍材料進行根腫病抗性鑒定

在東北農業大學甘藍課題組溫室內，采用1.2.2～1.2.5確定的最佳接種體系，對20份甘藍材料進行接種，每份材料30株，對照為已知感病品種‘京豐一號’，3次重復，培養6周后調查發病情況。

1.2.7 數據統計和分析

甘藍根腫病室內人工接種病情分級標準［3］如下：

單株分級標準：0級，根部無任何腫瘤；1級，主根腫大，其直徑小于2 倍莖基，或須根有小腫瘤；腫大部分直徑在4mm 以下；3級，主根腫大，其直徑為莖基的2～3倍，腫大部分直徑約4～6mm；5級，主根腫大，其直徑為莖基的3～4倍，腫大部分直徑約6～8mm；7級，主根腫大，其直徑為莖基的4倍以上，腫大部分直徑約8mm 以上。

病情指數（DI）＝∑（發病級代表值×各級病株數）×100／（調查總株數×最高級發病代表值）

甘藍根腫病群體抗性分級標準［10］如下：

免疫（I）：DI＝0；高抗（HR）：0＜DI≤5；抗病（R）：5＜DI≤15；中抗（MR）：15＜DI≤30；感病（S）：30＜DI≤50；高感（HS）：DI＞50。

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 病田土壤含菌量的測定結果

由20個樣點的土壤中休眠孢子含量（表1）可得，病田土壤中休眠孢子含量的平均值為1.6×108個／g土壤，此濃度作為接種試驗中接種濃度的參考指標。

表1 病田土壤中休眠孢子含量Table 1 Resting spores concentration in the field

2.2 不同接種方法對甘藍根腫病接種效果的影響

接種六周后，對發病情況進行調查，按照甘藍根腫病室內人工接種病情分級標準對接種植株進行分級，計算發病率和病情指數。從表2可以看出，3種接種方法均可使植株發病，其中菌土法接種效果最好，平均發病率為77.78%，平均病情指數為49.52；根際土壤注菌法效果次之，平均發病率為57.78%，平均病情指數為30.79；蘸根法效果較差，平均發病率為55.56%，平均病情指數僅為24.13。因此，3種接種方法中，以菌土法的接種效果最佳。

表2 不同接種方法下‘京豐一號’發病情況1）Table 2 The occurence of cabbage clubroot on‘Jingfeng 1’cabbage with different inoculation method

2.3 不同接種濃度對甘藍根腫病接種效果的影響

按1.2.4的方法制備的菌土，其病菌孢子含量分別為3.2×106、1.6×107、8×107、1.6×108、3.2×108和6.4×108個／g基質，各濃度處理4種供試甘藍的結果見表3～6，各表數據顯示：（1）6種不同濃度的菌土均可使甘藍幼苗發病，對同一種甘藍材料，隨著接種濃度的升高，發病率和病情指數也隨之升高；（2）接種材料‘京豐一號’為已知高感品種［3］，當菌土中孢子濃度為3.2×106、1.6×107和8×107個／g基質時，平均病情指數均小于30，說明這3種接種濃度在調查時間內不能真實地反映接種材料的抗性。

表3 不同接種濃度下‘京豐一號’發病情況Table 3 The occurence of cabbage clubroot on‘Jingfeng 1’cabbage under different inoculation concentrations

表4 不同接種濃度下‘PM’發病情況Table 4 The occurence of cabbage clubroot on‘PM’cabbage under different inoculation concentrations

表5 不同接種濃度下‘P3’發病情況Table 5 The occurence of cabbage clubroot on‘P3’cabbage under different inoculation concentrations

表6 不同接種濃度下‘3-1012’發病情況Table 6 The occurence of cabbage clubroot on‘3-1012’cabbage under different inoculation concentrations

表7為菌土中孢子濃度達1.6×108個／g時，4種供試甘藍材料各重復間病情指數，可以看出，各重復間接種結果比較穩定；表8～10為菌土中孢子濃度為1.6×108、3.2×108、6.4×108個／g時4種不同供試甘藍材料間方差分析，可以看出，在1.6×108個／g接種濃度下，材料間F值80.95（F＞F0.01）各材料間表現出明顯的抗性差異，方差分析極顯著（表8）；當菌土中孢子濃度達3.2×108和6.4×108個／g時，材料間F值分別為3.70和1.91（F＜F0.05），方差分析均不顯著（表9～10），表明在此兩種接種濃度下，材料間抗病性無明顯差異。綜上，接種濃度過高或過低都會影響鑒定結果的真實性，所以1.6×108個／g為最適接種濃度，能夠真實反映出供試材料的抗性，且能區分供試材料的抗感差異。

表7 接種孢子濃度為1.6×108 個／g時供試甘藍的病情指數1）Table 7 Disease index of the tested cabbage at inoculation concentration of 1.6×108spores per gram of substratum

表8 接種孢子濃度為1.6×108 個／g時供試甘藍的方差分析結果1）Table 8 Variance analysis of different cabbage materials at inoculation concentration of 1.6×108spores per gram of substratum

表9 接種孢子濃度為3.2×108 個／g時供試甘藍的方差分析結果Table 9 Variance analysis of different cabbage materials at inoculation concentration of 3.2×108spores per gram of substratum

表10 接種孢子濃度為6.4×108 個／g時供試甘藍的方差分析結果Table 10 Variance analysis of different cabbage materials at inoculation concentration of 6.4×108spores per gram of substratum

2.4 不同pH 條件對甘藍根腫病接種效果的影響

如表11所示，在pH 5.5～6.5范圍內，植株平均病情指數均大于30，符合‘京豐一號’的抗性指標［3］，當pH 6.0時發病最重，平均發病率為81.11%，平均病情指數為51.58。所以適宜根腫病發病的土壤pH 在5.5～6.5之間，最佳pH 為6.0。各結果同時證明甘藍根腫病發病嚴重度與土壤酸堿性有關，在偏酸性土壤中（pH 5.5、6.0、6.5）發病重于中性土壤（pH 7.0），而中性土壤（pH 7.0）下發病又重于偏堿性土壤（pH 7.5、8）。

綜上，甘藍根腫病的最佳接種方法為菌土法，最佳接種孢子濃度為1.6×108個／g，土壤pH 偏酸性利于發病。最終確定甘藍根腫病最佳接種體系：采用菌土法，菌根與滅菌基質以1∶10的比例混勻，用硫酸亞鐵溶液調節菌土基質pH 為6.0，進行接種。

表11 不同pH 的菌土對根腫病發病情況的影響Table 11 Effect of different soil pH value on occurence of cabbage clubroot

2.5 甘藍材料根腫病室內人工接種抗性鑒定結果

為了能給甘藍抗根腫病育種提供可靠的育種材料，對東北農業大學提供的20份甘藍材料在室內進行了人工接種抗性鑒定，按照甘藍根腫病室內人工接種病情分級標準進行分級（圖1）。

圖1 甘藍根腫病室內人工接種單株病情分級標準Fig.1 Grade standard of cabbage clubroot on individual plant by artificial inoculation indoors

鑒定結果，如表12所示，本次供試的20份材料中，沒有免疫（I）和高抗（HR）根腫病材料，其中抗病（R）材料有3份，分別為：P3、R、Q3；中抗（MR）材料9份，分別為：‘P1’、‘Q1’、‘Q2’、‘3-1005’、‘3-1012’、‘3-1015’、‘3-1017’、‘3-1020’、‘3-1021’；感病（S）材料有7份，分別為：‘PM’、‘P2’、‘P4’、‘3-1003’、‘3-1004’、‘3-1006’、‘3-1009’；高度感病（HS）材料1份：PF。

表12 甘藍種質資源的抗根腫病篩選結果Table 12 Screening results of resistance of cabbage germplasm resources against clubroot

3 討論

建立一套穩定的人工接種體系是抗病育種工作的基礎，本試驗以發病快、接種后抗／感反應穩定、并能正確劃分出品種真實抗性以及操作簡便為宗旨，篩選出一套與田間發病癥狀吻合的最佳甘藍根腫病接種體系。

接種方法、濃度及培養體系pH 條件是影響植物病害抗性鑒定準確性的重要因子，為建立一套可靠的甘藍根腫病接種體系，本研究針對這3種因素設計試驗，結果表明，所采用的3種接種方法中菌土法接種效果最佳，3種接種方法的接種物都為病原菌休眠孢子，區別在于菌土法是將腫根直接攪碎后拌入基質中進行接種，而其他兩種方法的特點是將分離自腫根中的休眠孢子配成懸浮液后作為接種液。根據接種效果的優劣，可以看出混有植物組織的病原孢子接種效果更好，推測可能是發病植株組織攪碎后的汁液可促進休眠孢子萌發，利于其侵染，要驗證此推測，還需要對根腫菌休眠孢子的萌發特性進行深入研究；不同接種濃度的測試表明，相對于同一甘藍材料，接種濃度越高，發病效果越好，相對于不同接種材料，當接種孢子濃度為1.6×108個／g時，能較好地區分出甘藍材料間的抗性，為最適接種濃度。

本次試驗測得根腫病在偏酸性（pH 5.5～6.5）條件下發病較重，最適發病的土壤pH 為6.0。關于不同土壤pH 條件對植株發病輕重的影響，前人研究存在一定爭議，普遍認為pH 5.4～6.5適宜該病發生［3，11-12］，但余漢清等［13］卻認為土壤pH 與發病率無關。對于甘藍在偏酸性土壤中易于感病，筆者分析可能與根腫菌的萌發特性有關，根腫菌的最適宜萌發pH 為6.0～6.7［9］，因此土壤pH 在此范圍內更利于根腫菌萌發產生游動孢子，從而侵染植株。

田間實際發病情況要受不穩定的環境條件影響，因此室內篩選出的抗性材料，在實際栽培過程中是否表現抗病，還有待進一步驗證，此外由于本次研究僅針對哈爾濱地區甘藍根腫菌菌源進行抗性鑒定，因而，篩選出的抗性材料是否抗其他地區甘藍根腫病不得而知，還需要進一步開展對甘藍根腫菌生理小種的研究。

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