引起大豆苗期根腐病的大豆擬莖點種腐病菌鑒定

耿肖兵，王春玲，黃銘慧，李永剛

（東北農業大學農學院，哈爾濱 150030）

大豆擬莖點種腐病菌（PhomopsislongicollaHobbs）屬間座殼目（Diaporthales）、擬莖點霉屬（Phomopsis）真菌，未發現其有性世代。該菌是重要植物病原菌，可侵染大豆、三葉草、綠豆、利馬豆、豌豆、花生、大蒜、洋蔥、辣椒、番茄、三裂葉豚草、蒼耳、地錦、皺葉酸模等［1］。大豆擬莖點種腐病菌是大豆生產上的一種重要病原菌，目前該菌在美國、阿根廷、意大利、韓國、南斯拉夫等都有報道［2-3］。在中國，Cui等2009年報道黑龍江省佳木斯市在大豆鼓莢期發生的莖枯病由大豆擬莖點種腐病菌引起［4］，Shan 等2012年報道了大豆擬莖點種腐病菌在南方引起大豆種子腐爛［5］，但目前尚未有報道在大豆苗期根腐病病樣中分離到大豆擬莖點種腐病菌。筆者對黑龍江省不同地理區域大豆苗期根腐病菌進行研究時，發現疑似大豆擬莖點種腐病菌分離物，并對這些分離物進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和供試植物

供試菌株：10個疑似大豆擬莖點種腐病菌分離物從大豆苗期根腐病株樣品上分離，并保存于4 ℃備用。

供試植物：致病性測定所用大豆品種為‘合豐25’。

1.2 致病性測定

供試菌株在PDA 平板上培養4d，用打孔器取直徑7mm 的菌碟接種到高粱粒培養基中（高粱粒開水煮20 min，然后撈到250 mL 三角瓶中，每瓶125g，然后濕熱滅菌121 ℃20min），每個三角瓶中接種5個菌碟，26 ℃培養箱中黑暗培養，期間每天振蕩三角瓶1次，約5d后，菌絲布滿每個高粱粒表面即可用于接種。接種方法為：在直徑8cm 培養缽中放入無菌蛭石至培養缽2／3處，之后每缽均勻接入10粒帶菌高粱粒，覆上約0.5cm 無菌蛭石后播種大豆品種，每缽10粒種子，最后用2cm 的無菌干蛭石覆蓋在種子表面，放入不銹鋼盤中，以不接種病原菌作對照，每個處理3缽（即3次重復），試驗重復2次。不銹鋼盤底部澆足水后放在溫室中，于25 ℃、L∥D＝12h∥12h 下培養，定期澆水保持蛭石濕潤，10d后調查結果。

病情分級參照張麗等［6］提出的標準，將根腐病嚴重度劃分為5個級別：

0級，無病；1級，須根根尖輕微變黑，主根不變，植株生長正常；3 級，須根根尖變黑，主根輕微變黑嚴重，植株生長正常；5級，主根變黑嚴重，地上部生長不良，或下胚軸腐爛，植株生長矮小；7級，根部腐爛，植株死亡。

病情指數＝100×∑（各級病株數×各級代表值）／（調查總株數×最高級代表值）。

獲得發病植株后取病組織再一次進行分離和純化，得到的分離物與第一次獲得的分離物進行形態學比對，確定其是否為該病害的病原菌。

1.3 病原菌形態特征觀察

分離物在PDA 平板上26℃黑暗下培養5d后觀察其菌落形態。取田間成株的大豆莖稈，截取5cm小段，用70%乙醇表面消毒后，無菌水沖洗干凈，放入具有4層滅菌紗布的無菌培養皿中，每段莖稈接帶培養基的菌絲塊1塊，保濕培養，每皿3段，26 ℃、L∥D＝12h∥12h條件下培養，40d后觀察分離物的子座、分生孢子器和分生孢子等。

將分離物菌落及孢子等的形態特征與引起大豆病害的不同真菌種類特征進行對比［7-9］。確定病原菌種類。

1.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

在形態學鑒定的基礎上，將分離物在PDA 培養基上26 ℃培養7d，刮取菌絲，采用CTAB 法提取DNA［10］，并采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行分子鑒定。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠檢測后送上海生工測序，將測序結果與GenBank中的ITS序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 致病性測定

利用大豆品種‘合豐25’進行分離物致病力的測定，10個分離物都能夠引起大豆苗期根腐病（表1），而且各菌株均表現出強致病力，發病率均在85%以上，病情指數為63.64～100.00，不同菌株致病力差異比較明顯，主根基本不變色或輕微變褐，須根不長且生長點變褐，植株生長正常；或主根嚴重變黑，較短，須根明顯減少或沒有，植株生長矮小，可能與其病原菌侵染的嚴重程度有關，總體說來，癥狀特點為：植株矮小，須根不長，主根較短（圖1）。通過對發病植株的組織進行分離培養，得到形態相同的真菌。

表1 10個分離物對大豆根腐病致病性測定1）Table 1 Pathogenicity determination of 10isolates causing soybean root rot

圖1 接種大豆擬莖點種腐病菌分離物后大豆根部發病癥狀Fig.1 Disease symptoms of soybean root after inoculation with isolates of Phomopsis longicolla

2.2 形態學鑒定

在PDA培養基上26℃黑暗培養5d，10個分離物菌落均棉絮狀，白色，菌絲密集，呈卷毛狀；培養基背面最初無色，隨后可見較大的、擴展的黑色子座（圖2）。在接種的大豆莖稈上產生的分生孢子器黑色，子座狀，單生或聚生，單室或多室，具顯著的喙。α型分生孢子大小約（5.8～7.8）μm×（1.4～2.1）μm，無色，紡錘形，單胞，有水滴狀斑點；β型分生孢子較少。這些分離物的培養及形態特征描述與大豆擬莖點種腐病菌（P.longicolla）相似。

圖2 菌株的形態特征Fig.2 Morphology of the strains

2.3 ITS序列分析

由于10株真菌分離物形態學上完全一致，因此選擇其中1個分離物用通用引物ITS1和ITS4對DNA進行擴增，得到的片段大小為549bp，將該分離物ITS序列與GenBank中大豆擬莖點種腐病菌（Phomopsis longicolla）進行同源性比較，與菌株MP4PL11PS（Gen-Bank登錄號HQ130441.1）同源性達98%。結合形態學和分子生物學鑒定的結果分析，該菌株為大豆擬莖點種腐病菌，能引起大豆苗期根腐病。

3 結論與討論

引起大豆根腐病的病原菌種類多，目前在中國已經發現并報道的有尖鐮孢（Fusariumoxysporum）、腐皮鐮孢（F.solani）、木賊鐮孢（F.equiseti）、禾谷鐮孢（F.graminearum）、燕麥鐮孢（F.avenaceum）、半裸鐮孢（F.semitactum）、輪枝鐮孢（F.verticillioides）、藍色鐮孢（F.coeruleum）、厚垣鐮孢（F.chlamydosporum）、層出鐮孢（F.proliferatum）、三隔鐮孢（F.tricinctum）、殼生鐮孢（F.episphaeria）、節狀鐮孢（F.merismoidescorda）、立枯絲核菌（Rhizoctoiasolani）、大豆疫霉（Phytophthorasojae）、終極腐霉（Pythiumultimum）、瓜果腐霉（P.aphanidermatum）［7-9，11-14］。雖然我國大豆根腐病菌種類豐富，但目前的報道認為危害較大的為尖鐮孢和腐皮鐮孢，其他病原菌危害面積及程度遠不及這兩種菌。本研究在黑龍江省不同地理區域進行大豆根腐病病原菌采集、分離和鑒定，發現在中國大豆苗期根腐病中未報道過的一種真菌病原物。通過形態學和分子鑒定，確定其是大豆擬莖點種腐病菌（P.longicolla），其所占分離物的比例為3.16%。

迄今，我國除海關在口岸查獲國外大豆攜帶大豆擬莖點種腐病菌（P.longicolla）外，該菌只有在大豆莖枯病和大豆種腐病中報道過3次［4-5，15］，在廣東茄子莖潰瘍病中報道過1 次［16］。在國內尚未報道從大豆苗期根腐病病樣中分離到大豆擬莖點種腐病菌（P.longicolla）。本研究在黑龍江省多地發現該病原菌引起大豆苗期根腐病。由于大豆擬莖點種腐病菌（P.longicolla）對大豆具有極強的致病力，對大豆生產的危害巨大，建議在我國開展該病的普查、藥劑篩選和抗源測定等工作，以防止該病原菌對我國大豆生產的潛在危害及在我國大豆產區蔓延。

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