芒果細菌性黑斑病菌在不同場所的存活期

漆艷香，張 賀，喻群芳，謝藝賢，張 欣，陸 英，張輝強，蒲金基

（中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，農業部熱帶農林有害生物入侵監測與控制重點開放實驗室，海口 571101）

芒果細菌性黑斑病是由野油菜黃單胞桿菌芒果致病變種（Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，Xcm）引起的細菌性病害，其病原菌是我國和世界許多國家的進境植物檢疫有害生物之一。自Doidge［1］首先報道芒果細菌性黑斑病在南非發生以來，該病相繼在印度、巴西、墨西哥、巴基斯坦、澳大利亞、加納、馬來西亞、日本等國發生［2］。1972年，在我國臺灣發現有該病的分布，隨后在廣東、廣西、云南、海南、福建和四川等省（區）均有發生并呈上升趨勢［3-5］。據調查，該病在我國芒果產區造成的產量損失一般為15%～30%，嚴重的可達50%［6］。目前該病在海南已逐漸成為芒果的第一大葉部和果面病害，嚴重影響了海南芒果的產量和質量，而現有防治效果不甚理想。明確病害的發生與流行規律，是制定病害防治方法的重要依據，但目前有關海南該病發生規律的系統研究尚未見報道。

芒果細菌性黑斑病暴發流行的主要初侵染源是越冬病枝、病葉上的病菌，尤以秋梢上的病菌最為重要。關于該病原菌在病斑中存活期的研究，國外有一些報道，但仍未有一致的定論［7-10］。此外，來源于土壤、水等其他場所的病原菌，其存活期以及在病害發生和流行中的作用等尚未見系統的研究報道。針對芒果細菌性黑斑病發生危害嚴重、而對該病流行學研究基礎薄弱的現狀，本文擬在海南省生態條件下，對芒果細菌性黑斑病病原菌在不同場所的越冬存活情況進行研究，以期為制定該病的綜合治理措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

芒果細菌性黑斑病菌（Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，Xcm）野生菌株、抗利福平菌株RifXcm 及芒果感病品種‘貴妃’的離體葉片均由中國熱帶農業科學院熱帶果樹病害課題組提供。

1.2 培養基

Xcm 擴大培養基（NA 培養基）：蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，瓊脂18g，雙蒸水1 000mL，121℃濕熱滅菌20min，pH 7.0～7.2。

Xcm 半選擇培養基（KC 培養基）［11］：酵母提取物7g，蛋白胨7g，葡萄糖7g，瓊脂18g，雙蒸水1 000mL，121℃濕熱滅菌20min后，溫度降至50℃左右，依次加入頭孢氨芐40mg／L，春雷霉素20mg／L，丙環唑20mg／L，pH 7.0～7.2。

1.3 人工接種Xcm

1.3.1 健康芒果葉片上接種Xcm 及Xcm 的保存

取1支在28 ℃活化3d的抗利福平菌株RifXcm 斜面純菌種，用無菌水配制成1.0×106cfu／mL細菌懸浮液，供接種用。2013 年8 月12 日取芒果感病品種‘貴妃’的健康葉片（本梢期達到最大面積時的新成葉）60片，每片葉進行葉背針刺接種，每葉共6個針刺點。取其中40片用滅菌濾紙圓片（直徑4mm）吸足RifXcm 菌懸液，貼在針刺點上。接菌后的葉片放置在吸水紙保濕的培養皿內，2 片／皿，20個重復，置于28 ℃恒溫培養箱，培養期間保持皿內有一定濕度，24h 后除去濾紙片，觀察葉片發病情況。將發病的葉片裝入尼龍網袋，20片置于室溫保存，另外20片葉用滅菌吸水紙壓制后置于15 ℃生化培養箱保存。無菌水接種的20片葉用滅菌吸水紙壓制后也置于15 ℃生化培養箱，作為陰性對照。定期分離和檢測葉片病斑里Xcm 的存活情況。

1.3.2 土壤中接種Xcm

將種植過香蕉、番木瓜等不同來源的土壤各5 kg均勻混合，用PCR 檢測［12］確認混合土不攜帶Xcm，將混合土裝入潔凈盆缽中，每盆裝土3kg。設無病殘體土壤、有病殘體土壤（每盆埋入剪碎搗爛的‘貴妃’芒果病葉和病枝條約500g）。2013年8 月12日進行人工接種，每盆接種200mL RifXcm 菌液（1.0×106cfu／mL），以不接菌為對照，淋自來水保持土壤濕潤。將接種后的盆缽置于露天開放的自然環境中，定期澆自來水保持適宜土壤濕度。定期分離和檢測土壤里Xcm 的存活情況。

從無病芒果園采集土壤裝入18支試管中（10g土／支），同時把其中9支試管濕熱滅菌（121 ℃1h）。2013年8月12日往18支試管中分別加入2mL 菌懸液（1.0×106cfu／mL），室溫保存用于定期分離和檢測土壤里Xcm 的存活情況，每次各檢測1 支試管。

1.3.3 水中接種Xcm

2013年8月12 日，用無菌水將活化后并培養48h的RifXcm 配制成1.0×107cfu／mL 菌液，先取200mL菌液加入已盛有1 800mL水庫水和自來水的盆缽，置于露天開放的環境中；取30 mL 加入盛有270mL無菌水的三角瓶（濕熱高壓滅菌），置于室內。定期分離和檢測水里Xcm 的存活情況。

1.4 Xcm 的分離及存活期檢測

分別采用直接分離、菌落PCR（Bio-PCR）和常規PCR 3種方法對人工接種的Xcm 的存活情況進行檢測，如能直接分離出Xcm，則對獲得的單菌落進行Bio-PCR；若不能直接分離出Xcm，則提取樣品DNA 進行常規PCR 擴增。

1.4.1 芒果葉片中Xcm 存活期

定期取人工接種的芒果病葉單個病斑于研缽中，加5mL無菌水碾碎后，浸泡0.5h。所獲浸提液以2 000r／min離心8min，取上清液用無菌水進行10倍梯度稀釋，各取50μL均勻涂布于含50μg／mL利福平的KC半選擇性平板上，28 ℃下培養3～4d，觀察RifXcm 菌落生長情況，并對獲得的單菌落進行PCR檢測驗證。

1.4.2 土壤中Xcm 存活期

定期取人工接種Xcm 的無病殘體土壤和有病殘體土壤各10g于研缽中碾碎后加50mL無菌水，浸泡1h；定期取滅菌與未滅菌的試管各1支，往每支試管中加入10 mL 無菌水，浸泡0.5h。所獲浸提液以2 000r／min 離心8min，取上清液用無菌水進行10 倍梯度稀釋，各取50μL 均勻涂布于含50 μg／mL利福平的KC半選擇性平板上，28 ℃下培養3～4d，觀察RifXcm 菌落生長情況，并對獲得的單菌落進行PCR 檢測驗證。

1.4.3 水中Xcm 存活期

定期取水10mL，用無菌水進行10倍梯度稀釋，各取50μL均勻涂布于含50μg／mL利福平的KC半選擇性平板上，28℃下培養3～4d，觀察RifXcm 菌落生長情況，并對獲得的單菌落進行PCR檢測驗證。

1.5 Xcm 的PCR 檢測

分別按植物DNA 小量提取試劑盒（Omega）和PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio）說明書提取芒果葉片gDNA、水gDNA 和土壤gDNA。菌落PCR與常規PCR均采用Xcm 的特異性引物，XcmHF（5′-GGT GGT CGA ACT CGT CGG CAT-3′）／XcmHR（5′-GCC TGC GCC TGG ATC GGT AT-3′）進行擴增［12］。PCR擴增產物片段大小為321bp。

擴增體系均為25μL：10×PCR buffer（Mg2＋plus）2.5μL，dNTP mixture（各2.5mmol／L）2μL，正向和反向引物各（20μmol／L）各0.5μL，高保真Taq酶（TaKaRa）（5 U／μL）0.2μL，模板DNA（20 ng／μL）1μL，補滅菌雙蒸水至25μL。引物擴增條件：94 ℃3 min；94 ℃45s，62 ℃1min，72 ℃1 min，30個循環；72 ℃5min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 Xcm 在葉片病斑上的存活期

每隔30d對接種葉片進行半選擇性平板直接分離和Bio-PCR 驗證，同時提取葉片DNA 進行PCR 檢測，以確定葉片中Xcm 的存活情況。RifXcm 菌株在含利福平的KC 培養基上菌落乳白色、圓形、輕微凸起、邊緣整齊、黏液狀。分離結果表明，接種120d后，采用選擇性培養平板能分離出Xcm（表1，圖1），接種150d 后直接分離不到Xcm，180d后室溫保存的葉片用2 種方法都檢測不到Xcm，而只有低溫保存的葉片gDNA 能檢測到Xcm（表1，圖2），210d后低溫保存的葉片用常規PCR檢測不到Xcm，說明Xcm 在葉片病斑內常溫下至少存活5 個月，15 ℃低溫下至少可存活6個月。

表1 Xcm 在人工接種葉片上的存活期1）Table 1 Survival period of Xcm in mango leaves with RifXcm inoculated

2.2 Xcm 在土壤和水中的存活期

2.2.1 直接分離和Bio-PCR

每隔7d采用直接分離法從人工接種的無病殘體土壤、病殘體土壤、室內未滅菌土、滅菌土、水庫水、自來水和無菌水等7種場所中分離Xcm，并用菌落PCR檢測驗證KC半選擇性培養基上獲得的疑似單菌落是否為活的Xcm。結果表明，接種28d后的無病殘體土壤、病殘體土壤、室內未滅菌土和滅菌土中都能分離到Xcm，35d后無病殘體土壤和室內未滅菌土中均分離不到Xcm，49d后病殘體土壤中分離不到Xcm，70d后室內滅菌土中分離不到Xcm。同樣，接種28d后水庫水、自來水及無菌水中都能分離到Xcm，35d后水庫水中分離不到Xcm，49d后自來水中分離不到Xcm，175d后滅菌水中仍能分離到Xcm。

圖1 接菌120d后菌落PCR 檢測芒果葉片XcmFig.1 Detection of Xcm from mango leaves at 120d after inoculation by colony PCR

圖2 接菌180d后常規PCR 檢測芒果葉片XcmFig.2 Detection of Xcm from mango leaves at 180d after inoculation by conventional PCR

2.2.2 PCR 檢測

由于Xcm 在自然環境中易受環境因素和其他微生物的影響，人工模擬接種后，Xcm 在28d后數量減少，用常規分離培養方法靈敏度有限，無法直接分離目標菌Xcm，因此，本試驗進一步選用靈敏度更高的PCR 檢測方法，用試劑盒提取土壤和水中的細菌gDNA，用Xcm 特異性引物PCR 檢測不同場所中Xcm 的存活情況。

從接種后的第35 天起，提取供試土壤gDNA進行PCR 檢測。結果表明，接種42d后無病殘體土壤和室內未滅菌土中仍然檢測到Xcm，在第49天則檢測不到；在接種含病殘體的土壤中63d之內均能檢測到Xcm，而室內滅菌土在77d之內還能檢測到Xcm，表明Xcm 在病殘體土壤和室內滅菌土存活期稍長，但也非常有限，分別為49～63d和70～77 d。由此可知，Xcm 在土壤中存活期短，不可能在田間土壤中越冬而成為第2年初侵染源。

從接種后的第35 天起，提取供試水gDNA 進行PCR 檢測，結果表明，接種42d后，水庫水檢測不到Xcm，56d 后自來水中檢測不到Xcm，說明Xcm 在水庫水和自來水中存活期有限，分別為35～42d和49～56d。而在無菌水中，280d之內還能檢測到Xcm，說明Xcm 在無菌水中至少能存活10個月。由此可知，Xcm 在自然水中存活期較短，也不可能在田間水中越冬而成為第2年初侵染源。

3 結論與討論

大量研究表明，控制和清除病害的初侵染源，是植物病害防治的關鍵技術之一，因此弄清楚芒果細菌性黑斑病菌在不同場所中的存活期是十分必要的。本研究通過人工接種的方法研究了芒果細菌性黑斑病菌在葉片、土壤和水等場所中的存活時間，結果表明，芒果細菌性黑斑病菌在接種葉片病斑內常溫下至少可存活5個月，15 ℃低溫下至少可存活6個月。這一研究結果與前人研究基本一致［7］，他們認為“病株病斑內的病原菌存活期較長，是病害發生發展的最主要的再浸染源”。此外，由于芒果為常綠果樹，只要有充足的雨水或灌溉，周年均可抽梢生長。3-5月抽生的枝梢為春梢，6-8月為夏梢，9-11月為秋梢，12-2月為冬梢，而在海南秋梢是主要結果母枝。這一研究結果表明，前一年的秋梢、夏梢葉片病斑內的病菌均能安全越冬成為第2 年初侵染源，其中以秋梢病斑內的病菌最為重要。

植物病原細菌單獨在土壤中的存活期一般是很短的［13］。芒果細菌性黑斑病菌在無病殘體土壤、病殘體土壤和室內未滅菌土存活期均有限，其中以病殘體土壤存活期稍長（49～63d），研究結果與Pruvost ＆Manicom［14］的結論一致，他認為“自然情況下黑斑病菌在土壤中的存活期有限”。因此，年前這些場所的病菌均不能越冬成為翌年的初侵染源。但假若夏季病果園土壤中有一定數量的病原菌存在，就有可能借雨水濺散至植株枝葉上而成為再侵染源。另外，病菌在水庫水和自來水中的存活期分別為35～42d和49～56d，因此來自病果園的雨后流水（帶菌）流經無病果園時，有傳病的可能。而有關芒果細菌性黑斑病菌在作為主要初侵染源之一的枝條及其他初侵染源如未顯癥葉片及雜草等上的存活期，還有待進一步研究。

［1］Doidge E M.A bacterial disease of the mango，Bacillusmangiferaen.sp［J］.Annals of Applied Biology，1915，2（1）：1-45.

［2］中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局，中華人民共和國廣東出入境檢驗檢疫局.GB／T 28094-2011，芒果細菌性黑斑病菌檢疫鑒定方法［S］.北京：中國標準出版社，2011.

［3］Liao C H.Studies on mango fruit spotⅠ.Symptoms and causal organisms［J］.Journal of Taiwan Agricultural Research，1972，21（2）：146-150.

［4］Liao C H.Studies on mango fruit spotⅡ.Pathogenicity［J］.Bulletin of the Taiwan Agricultural Research Institute，1975（32）：62-66.

［5］文衍堂，黃圣明.芒果細菌性黑斑病癥狀與病原菌鑒定［J］.熱帶作物學報，1994（1）：79-85.

［6］董春，何漢生.芒果細菌性黑斑病研究進展［J］.果樹科學，1999，16（S1）：47-51.

［7］Gagnevin L.Analyse de la diversitégénétique deXanthomonaspv.mangiferaeindicaeet sa signification dans le pouvoir pathogène et la biologie de la bactérie［D］.INA P-G，Paris，France：Implications dans l’épidémiologie de la maladie des taches noires du manguieràl’?le de la Réunion，1998.

［8］Manicom B Q.Factors affecting bacterial black spot of mangoes caused byXanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae［J］.Annals of Applied Biology，1986，109（1）：129-135.

［9］Pruvost O，Couteau A，Verniere C，et al.Epiphytic survival ofXanthomonascampestrispv.mangiferaeindicaeon mango buds［J］.Acta Harticulturae，1993（341）：337-344.

［10］Gagnevin L，Pruvost O.Epidemiology and control of mango bacterial black spot［J］.Plant Disease，2001，85（9）：928-935.

［11］Pruvost O，Roumagnac P，Gaube C，et al.New media for the semi selective isolation and enumeration ofXanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，the causal agent of mango bacterial black spot［J］.Journal of Applied Microbiology，2005，99（4）：803-815.

［12］中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所.NY／T2257-2012，芒果細菌性黑斑病原菌分子檢測技術規范［S］.北京：中國農業出版社，2012.

［13］許志剛.普通植物病理學［M］.北京：中國農業出版社，1997：150-177.

［14］Pruvost O，Manicom B Q.Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae，cause of bacterial black spot of mangoes［M］∥Swings J G，Civerolo E L.Xanthomonas.London，United Kingdom：Chapman ＆ Hall，1993：91-95.