水稻花藥培養技術及其育種應用的研究進展

吳 丹，姚棟萍，李鶯歌，吳 俊，伍富根，鄧啟云,3

（1. 湖南農業大學農學院，湖南 長沙410128 ； 2. 雜交水稻國家重點實驗室，湖南 長沙410125；3.中南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙410125）

水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物之一，中國是世界上最大的水稻生產國。水稻的矮化育種和雜交水稻育種，實現了中國水稻單產的兩次跨越式發展。目前,我國正在醞釀著水稻育種的第三次飛躍，即以水稻亞種間雜種優勢利用為主的超級稻育種[1]。但是秈粳亞種間雜交后代，存在結實率低、性狀不易穩定和瘋狂分離等問題?；ㄋ幣囵B（花培）又叫單倍體培養，是用處于特定時期的花藥經人工離體培養，使花藥中的花粉粒單性發育成單倍體植株的過程。單倍體植株經過自然或人工處理，染色體加倍形成純二倍體，后代性狀穩定。與常規育種方法相比，花藥培養技術有著可縮短育種年限、后代遺傳變異類型豐富、選擇效率高等優點[2]。近年來，花藥培養技術在水稻育種中被廣泛研究。筆者從影響水稻花藥培養的因素、存在的問題以及下一步的研究方向等方面進行探討，以期為花藥培養實踐提供理論參考。

1 水稻花藥培養研究的回顧

日本學者新關宏夫于1968年用花藥離體培養首次得到了花培植株，開啟了花藥培養研究的先河[3]。我國水稻花藥培養的研究開始于1970年，1975年首次利用花培技術育成了粳稻新品種單豐1 號。之后研究者們紛紛開展提高水稻花培效率的相關研究，并將花藥培養技術與育種相結合[4]，在選育新品種，創新原始材料，不育系、恢復系的選育與提純方面，都取得了一定的成效。通過花藥培養相繼育成了一系列性狀優良的品種，如中國農業科學院選育的中花系列品種、黑龍江省農業科學院選育的龍粳系列品種、天津市農作物研究所選育的花育系列品種等[5]。目前，通過花培選育的常規水稻品種已有近40個。

亞洲栽培稻包括秈稻和粳稻兩大亞型。粳稻相對來講較易誘導，其花藥培養在育種中已取得良好的效果[6]。而秈型水稻，由于出愈率較低，有些材料甚至難以誘導出愈傷組織[7]，其花粉培養的株產率平均只有1%～3%[8]，所以花藥培養技術在秈稻育種中的應用還十分有限。目前，通過花培選育的秈稻品種還比較少，至20 世紀末僅有5個，且推廣面積都不大。突破秈稻花藥培養技術難點，加快秈稻花培在育種中的應用是當前水稻花培亟待解決的難題。

2 影響水稻花藥培養力的因素

2.1 基因型

供體品種的基因型是影響水稻花藥培養最關鍵的因素，不同基因型的水稻品種，其花藥培養力存在明顯差異。沈錦驊等[9]對比分析了各種類型的水稻材料之后，得出各類型水稻的花藥培養力由強到弱依次為糯稻＞粳稻＞秈粳型雜交稻＞秈稻，但不同材料之間差異較大。陳兆貴等[10]的研究表明，花藥培養力是受親本控制的遺傳性狀，如果父本和母本的培養力均較強，F1 代的培養力也會較強。并且有研究顯示，愈傷組織的誘導和綠苗的分化之間相關性顯著，且均是由多基因控制的數量性狀[11]。其中，影響花藥培養力的基因被認為在1 號染色體上，而控制綠苗與白苗分化比例的基因位于10 號染色體上[12]。何平等[13]對110個DH 系進行花藥培養力的數量性狀位點（QTLs）分析，得到了與愈傷組織誘導有關的5個QTLs，分別分布在第6、7、8、10 和12 號染色體上，與綠苗分化率有關的2個QTLs 分布在1 號和9 號染色體上。研究認為，如果將能提高愈傷誘導率和綠苗分化率的QTLs聚合在一起，篩選出愈傷誘導率和綠苗分化率均較高的材料，將大幅度提升花藥的培養力。

2.2 取材與預處理

單核靠邊期是水稻花藥培養的最佳時期?；ㄋ庍^老或過嫩，都會影響愈傷的誘導率。田間取樣的最佳時間一般為晴天的上午8︰00～10︰00 或下午16︰00～18︰00，此時細胞處于旺盛的分裂期。在試驗過程中，可通過某些器官的形態特征來判斷花藥的發育時期。通常，花藥的單核靠邊期，穗子苞大而不破，穎殼淺綠色，花藥淡黃色，花藥長度伸長至穎殼2/5～1/2處，劍葉與下一葉的葉枕距為5～10 cm[14]。但這種形態判斷指標比較粗放，不同的材料間存在較大差異，故不同的材料取材時要綜合衡量。

低溫預處理是提高花培效率最常規有效的手段，可使水稻愈傷組織誘導率提高幾倍至幾十倍。低溫處理的作用機制是延緩花粉的退化、維持花粉發育的生理環境、提高內源生長素水平、降低乙烯含量、啟動雄核發育等。張躍非等[15]認為低溫預處理的最適溫度為8℃，時間以8 d 為宜。目前4℃處理7 d，或7～8℃處理8～10 d，都可獲得較好的效果。但最佳處理溫度和時間因材料而異，一般來說較低的處理溫度需要較短的放置時間，較高的處理溫度需要較長的放置時間。

2.3 培養基

2.3.1 培養基的種類與成分 培養基的類型也是影響水稻花培效率的重要因素之一。不同的試驗材料，適用的培養基不一樣。目前，還沒有一種萬能的培養基能適用于各種不同類型水稻材料的花藥培養。培養基中氨態氮與硝態氮的比例及氨離子的用量對花培的影響較大，秈稻氨離子以3.5 mmol/L 效果較佳，粳稻的則為7 mmol/L，秈粳交雜種的介于兩者之間。鎂離子的用量，對花培效率也有一定影響。朱至清等[16]的研究表明，鎂離子以2.2 mg/L 較好，不僅有利于愈傷組織的誘導，還有利于綠苗的分化。適宜的鐵離子濃度，也能夠提高花藥培養力。過壘生等[17]的研究表明，鐵離子的用量與2,4-D 的濃度有關。研究者為了得到最佳的培養效果，通過改變培養基中各組分的用量，設計了多種培養基。其中，N6 培養基適用于粳稻的花培，合5 培養基適用于秈稻[18]，改良的M 8、SK3培養基則對秈粳雜種有較好誘導效果[19]。馮雙華等[20]的研究表明，改良的M 8 培養基對基因型不同的材料有較廣泛的適應性。培養基的各種組分相互作用相互影響，如果要通過逐個試驗去找到每個元素的最佳用量，不僅工作量大，而且成效不一定顯著，因此在篩選培養基種類時抓住主次顯得尤為重要。

2.3.2 激素配比 花藥離體培養過程中，生長調節物質的用量和配比對愈傷組織的誘導和綠苗的分化都至關重要。有研究表明，在只含2,4-D 的誘導培養基上，愈傷組織比較松軟，呈黏液化，較難分化。而在誘導培養基上添加NAA 和KT，可以改善愈傷組織質量，提高愈傷組織的誘導率[21]。復合激素能顯著提高水稻花藥培養力，不同材料的最適激素種類及配比差異較大。馮雙華等在秈型水稻材料中，添加1.5 mg/L的2,4-D 和NAA 取得了較好的誘導效果。在培養基中添加KT 可以提高愈傷的誘導率，但是提高誘導率的同時也增加了白苗率?？傮w來說，秈稻所需要的激素含量更高，激素種類和配比因材料而異。

2.3.3 碳源與其他添加劑 碳源不僅提供能量，而且是培養基滲透環境的主要調節物質。糖類是主要的碳源，蔗糖被認為是植物組織培養的標準碳源，一般認為3%～6%的蔗糖為水稻花藥培養的常規用量。孫宗修等研究發現在麥芽糖為碳源的培養基上，愈傷組織平均誘導率顯著高于以蔗糖為碳源的培養基。麥芽糖并不是適用于所有基因型的水稻材料，有些材料在麥芽糖為碳源的培養基上誘導出的愈傷組織質量較差。另外，也有用砂糖做碳源取得較好誘導效果的研究報道。但可能是砂糖純度低，除了提供能量和滲透壓外，還補充了一些微量元素，從而提高了花藥的培養力。其他一些添加劑對于提高花藥培養力也有一定效果。在培養基中添加脯氨酸、水解酪蛋白、山梨醇等營養物質，可以緩解愈傷長勢不好的狀況[22]。添加山梨醇可明顯改善愈傷組織生長狀況，提高其再分化能力；活性炭是最常用的添加劑，有研究表明，活性炭可以提高煙草花培的出苗率[23]。丁元豐等[24]認為活性炭對苗高、根長、根數和鮮重均有顯著促增作用。還有報道稱，鍺能夠降低白苗率，多效唑能明顯提高綠苗分化率和壯苗等[25]。馮英等[26]研究發現，添加1 mg/L 的烯效唑（S-3307）能促進愈傷組織的誘導率和綠苗分化率。

3 水稻花培亟需解決的問題及對策

3.1 基因型的影響

基因型是影響水稻花藥培養力最關鍵的因素。秈稻花藥培養力很低，阻礙了其在育種上的應用。要提高秈稻的花藥培養力，最根本的辦法是通過雜交等遺傳改良手段，把高培養力基因導入到優良親本或雜種中，通過改變基因型，來提高材料的花藥離體培養能力。但要通過這種辦法同時得到農藝性狀良好，花藥培養力高的材料還存在一定困難。目前，常用的方法是從已有的優良性狀材料中，篩選出花藥培養力高的材料進行花培。一般而言，粳稻花藥培養力大于秈稻，在育種中常以粳稻作為橋梁親本，來提高秈稻花藥培養力。但橋梁親本重復使用，會使遺傳血緣日益狹窄。如果以廣親和品種為橋梁親本，可在一定程度上減輕這一狀況。為了解決水稻遺傳背景貧乏的問題，可收集大量的野生稻做原始材料，進行廣親和性雜交研究，使花藥培養在材料上取得突破，以發揮花培育種的優勢。

3.2 褐化

花藥的褐化是指花藥在培養過程中釋放褐色物質，花藥逐漸變褐而死亡的現象?；ㄋ幚锩娴男℃咦影l育需要花藥提供營養，誘導早期，花藥褐化，小孢子將會由于得不到充足的營養而退化，從而影響愈傷組織的誘導形成。褐變發生的條件很復雜，不只是多酚和多酚氧化酶直接作用的結果[27]。引起花藥褐化的因素很多，首先取材時期特別關鍵，單核靠邊期是花粉培養的最佳時期，過老的花藥在培養過程中更容易引起褐化。另外，光照過強和較高的培養溫度均會提高氧化酶的活性，從而促進酚類物質氧化而引起褐化。還有研究表明，降低培養基中無機鹽濃度和微量元素錳的含量也可以降低褐化率。

3.3 白化

白化是指離體培養得到的幼苗整株或部分失綠，表現為白色或者黃色，白化植株的產生是禾本科植物花藥培養的特征之一。有研究認為，這可能是禾本科植物DNA 共同的特殊性，他們對離體條件十分敏感，易發生缺失或其他變異[28]?？臻g誘變能改善一些誘變材料的白苗分化率，但綜合性狀表現仍然較差[29]。陳啟偉等[30]認為液體培養基可以提高綠苗率。另外，降低培養基中無機鹽濃度和微量元素錳的含量，在不影響正常生長和分化的前提下降低溫度，減少光照均可以降低白苗率[31]。在誘導培養基中，添加過量的2,4-D或者KT，可提高愈傷組織的誘導率，但同時也提高了白苗率。因此，在培養過程中愈傷組織要給予充足的營養，減少不當的刺激。目前，白苗現象仍然是一個難以解決的問題。

4 結語

雜交水稻育種從雜種優勢利用水平上，分為品種間、亞種間和遠緣間雜種優勢利用3個階段。品種間由于親緣關系較近使得雜種優勢弱；亞種間尤其是秈粳間雜種優勢更明顯，產量潛力大，但采用傳統方法來穩定秈粳亞種間雜交后代性狀的時耗長、難度大，而花藥培養可加快后代性狀的穩定速度，縮短育種時間。目前，大部分水稻的花藥培養力仍然較低，尤其是秈稻，很難滿足育種需求。攻克秈稻出愈率低、愈傷組織易褐化、白化等瓶頸，全面提升水稻花藥培養技術是現代育種的迫切要求?；蛐褪怯绊懟ㄋ幣囵B力的關鍵因素，但培養條件同樣重要?；蛐头矫妫蓮男誀顑灹嫉乃静牧现羞x擇花藥培養力高的材料進行培養，或通過導入高培養力基因來提高材料的花藥培養力。培養條件方面，取材時期、預處理、培養基、激素、添加劑，培養環境等均會影響花藥培養力，不同材料的適宜培養條件各異，所以要在前人經驗的基礎上不斷探索，因材料而異地尋找某種或者某類材料的最佳培養條件。在今后研究中，要進一步研究花藥離體培養體系和遺傳機理等課題，完善花培育種模式，使花藥培養技術尤其是秈稻花培技術更加成熟，更好地為水稻育種服務。同時，也要將花藥培養與轉基因、分子標記等分子生物學技術相結合，加快育種進程，提高育種效率。

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