H22昆明鼠肝癌原位模型的建立①

侯 杰，羅 蘭，焦成斌，楊彥民，何其勇，張曉麗，劉偉新

(佳木斯大學附屬第一醫院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

H22昆明鼠肝癌原位模型的建立①

侯 杰，羅 蘭，焦成斌，楊彥民，何其勇，張曉麗，劉偉新

(佳木斯大學附屬第一醫院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:建立H22昆明鼠肝癌原位模型,探討其基礎和臨床應用價值,為肝細胞癌的實驗研究打下基礎。方法:嚴格無菌及無瘤技術條件下開腹為100只雄性昆明鼠采用肝癌H22細胞株肝臟接種，建立小鼠肝癌原位模型。結果:100只昆明鼠中有95只造模成功，22只小鼠出現肝癌右葉轉移。結論:H22昆明鼠肝癌原位模型成功率高，成本低，值得推廣,是非常理想的研究肝癌的實驗動物模型。

H22；肝癌；原位模型；動物實驗

原發性肝癌(HCC)是嚴重危害人類生命健康的重大疾病，其惡性程度高,預后極差，素有“癌中之王”的稱號。在我國惡性腫瘤中的死亡率僅次于胃癌，居于第二位，且發病率仍在逐年上升，某些省市統計胃癌發病率，死亡率已經躍居第一位。目前，世界上各國都積極致力于肝癌的基礎和臨床研究，為肝癌的治療提供了可靠的基礎依據，其中，肝癌的動物模型是原發性肝癌臨床與基礎研究工作的最重要工具，肝癌動物模型是進行肝癌實驗研究的重要平臺和手段[1]。因此,無論是從基礎和臨床研究的角度及對肝癌進行治療的領域，我們都有必要建立一個理想的類似人肝癌的動物模型,這一點對于研究及探討原發性肝癌的發生、發展、轉歸及藥物治療均有著極其重要的意義，在各種動物模型中，小鼠肝癌原位移植模型能更好地模擬人類肝癌在體內的生長環境，更能客觀真實的反映人類肝癌的發生、發展、侵襲及轉移的過程，具有極高的基礎及臨床應用價值，尤其值得提出的是在本實驗造模過程中，筆者充分發揮了腫瘤外科的優勢，采用無瘤操作原則，有效的避免腫瘤細胞逃逸及種植，與以往的各種造模方法比較，有效的避免了腫瘤細胞脫落，逃逸，腹腔種植導致的腹水形成，筆者的造模方法失敗率低，模型成功率高，值得推廣。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

①實驗動物昆明種小鼠，體重18～22g，雄性，各小鼠間比較差異無統計學意義(均P>0.05)。②腹水型肝癌H22細胞株，1640培養基，磷酸鹽緩沖液，PBS溶液。

1.2 實驗方法

H22肝癌細胞株為實驗室動物房內昆明鼠腹腔內傳代保存。進行實驗時無菌操作,抽取腹腔接種H22肝癌細胞株的小鼠腹水，在腹腔液中加入PBS液,低速離心，顯微鏡下計數H22細胞數,用生理鹽水調整單細胞液濃度為2×107/mL備用。接種數量為H22小鼠肝癌單細胞懸液0.05mL(1×106個細胞)于小鼠左肝膈面。

手術步驟取小昆明鼠，抓取固定，腹部剃毛，75%醫用酒精消毒，按小鼠體重的0.3%比例行水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉起效后，將小鼠四肢固定于小手術臺上，腹部75%醫用酒精再次消毒，取劍突下上腹正中切口，長約1.0cm，剪開皮膚，腹白線，腹膜，壓迫止血，輕輕擠壓小鼠雙側腹壁，將小鼠肝左葉擠壓出腹腔，將1×106個H22腫瘤細胞注入左肝膈面實質內，退出針頭，輕壓針眼，取灼紅的鐵絲輕灼針眼，封閉針道，以防止腫瘤細胞逃逸，發生腹腔種植，將肝左葉輕輕送回腹腔，查無活動性出血，取1號絲線分別縫合腹白線及皮膚，再次消毒，術畢。

2 結果

術后一周將100只小鼠麻醉后剖腹檢查，其中，95只小鼠左肝葉可見腫塊，病灶突出肝臟表面，灰白色，質硬，造模成功,成瘤率為95%。病理學觀察可見核異型性明顯的H22腫瘤細胞成巢團狀、塊狀或彌漫散在分布于肝臟組織，其中，22只小鼠出現右肝葉轉移。

3 討論

H22肝癌細胞屬于腹水型肝癌細胞，國內外各實驗機構在既往的造模過程中，往往因無法很好的解決H22腹腔種植，腹水形成的問題從而導致造模失敗，采用筆者的方法，簡便易行，費用低，可很好的解決因腫瘤細胞逃逸，腹腔種植導致腹水形成的問題，模型成功率高，效果確切可靠，值得大力推廣。

在基礎和臨床的腫瘤研究中，實驗動物模型是人類腫瘤的復制，一定程度上客觀反映人類腫瘤疾病的發生、發展、侵襲及轉移的過程。動物模型在腫瘤發生機制，病理基礎研究及治療藥物篩選等領域發揮著重要作用。肝癌動物模型是進行肝癌實驗研究的最重要平臺和方法。從19世紀以來各國均有許多實驗室致力于小鼠肝癌模型的研究，期望通過對動物肝癌模型的研究，從根本上治愈這一疾病，直到20世紀初，人們經過不懈的努力，終于獲得小鼠自發性肝癌模型，世界各國研究人員通過對肝癌動物模型不懈研究，終于,逐步建立了動物的自發性、誘發性、移植性、人類肝癌的異種移植模型以及轉基因動物肝癌模型[2～4]。當然，各種的動物肝癌模型都各自有其優缺點，其中，自發性腫瘤動物模型存在誘導時間長、誘導因素干擾多，肝癌病灶的發生時間、病變數目、大小、部位等個體差異較大。誘發性腫瘤動物模型存在肝癌發病率低，實驗動物浪費率高，模型穩定性差，其病變的發生時間點較難預測的缺點，因此，該模型具有較大的研究局限性。而近年來，伴隨著分子生物學和轉基因技術的飛速發展，成功的建立了轉基因動物肝癌模型，該模型的建立使得肝癌的治療研究手段極大豐富，客觀上推動了肝癌發病機制的分子基礎的研究，但于此同時，因制作某些動物模型的復雜性及實際花費的高昂費用，在很大程度上限制了該種模型在我國的推廣和普及。。移植型腫瘤動物模型是指將來源于人動物或的癌細胞株或癌組織塊通過手術或注射接種于實驗動物體表、體內或機體其它部位所形成的腫瘤模型，其中以裸鼠最常應用。1969年Rygaard通過實驗研究證實了人肝癌裸鼠移植模型是除人體外最接近于人肝癌的實驗模型，該種模型的最大特點是造模周期短、成功率高，該模型根據癌細胞或癌組織移植的不同部位可分為：皮下、肝臟(原位移植)以及腹腔內種植。在移植瘤模型中，既往最常采用異位皮下移植，該方法雖然成瘤率高，但因受血供及細胞因子等微環境的限制，不能反映腫瘤在人體中的特征[5]。與皮下移植瘤相比，原位移植具有血液供應豐富及局部微環境更接近人體等優越性，不僅移植成功率高，而且更利于形成轉移[6]，因此，國內大多數研究機構及實驗室都是以移植性動物模型為主要研究工具，原位腫瘤移植模型它具有原腫瘤的組織結構，有高度的臨床相關性，同時還保持了絕大多數的生物學特性，其中還包括轉移特性，在這一新型模型的啟發下，人們相繼建立了多種腫瘤的裸鼠移植模型，但由于裸鼠費用較高，造模操作過程中死亡率較高，在國內一些基層實驗室中很難常規開展，而昆明鼠作為原位移植模型的研究可有效解決這一難題，昆明鼠作為一種易飼養，易存活，更經濟的實驗動物，在實驗研究中發揮著重大的作用，可以普遍開展，更好，更高效的推動肝癌疾病的基礎和臨床研究。

臨床上，腫瘤是機體中正常細胞在不同的始動與促進因素的長期作用下，所產生的增生與異常分化所形成的新生物，腫瘤的發生發展是一個連續的，多因素相互作用所造成的不良后果，在實際工作中，以人體本身作為實驗對象深入研究和探討腫瘤的發生機制是緩慢而又難以控制的，有些疾病還與倫理學相悖，開展起來非常困難，以此積累的實際經驗是有限的，不真實的、不可靠的，而借助于動物模型的研究，可以很好的解決這一難題，我們可以準確的觀察模型的實驗結果，與人類疾病進行比較對照、分析，有助于快捷、有效、方便的認識人類疾病。在本實驗中，應用肝癌H22細胞直接種植于昆明鼠的肝內，具有高度的臨床相關性，使其更好地模擬肝癌在人體內的生物學特性，具有極大的應用價值，且其造模成功率高，易于制作，有望成為未來人類研究肝癌的重要動物實驗模型。

[1]陳謙，孫慧，李強, 醫學實驗肝癌動物模型的研究進展[J].中華實驗外科雜志，2006,23(3):377-378

[2]Thorgeirsson SS，Facotr VM,Snyderwine EG. Transgenic mouse models in carcinogen sis research and testing[J]. Toxi Col Lett,2000,112(113):553-555

[3]Li Y，Tian B，Yang J，et al. Stepwise metastatic human hepatocellular carcinoma cell model system with multiple meta-static potentials established through consecutive in vivo selec tion and studies on metastatic characteristics[J]. J Cancer Res C lin Oncol，2004,130(8):460-468

[4]Yang JH，You TG，Li N，et al. Relationship between the imaging features and pathologic alteration in hepatoma of rats[J]. World J Gastroenterol，2003,9(1):69-72

[5]Yin K, Liu Q, Zhu S, et al. Adenovirus-mediated siRNA inhibited survivin gene expression induces tumor cell apoptosis in nude mice[J]. Biosci Trends, 2008,32(6): 231-234

[6]Otte A, Gabriel G. 2009 pandemic H1N1 influenza A virus strains display differential pathogenicity in C57BL/6J but not BALB/c mice[J]. Virulence, 2011,19(6): 563-566

2013黑龍江省自然基金課題，編號：41429004-4-13036； 2013佳木斯大學青年基金項目，編號：Sq2013-023。

侯杰(1978～)男，黑龍江佳木斯人，在讀博士研究生。

劉偉新(1960～)男，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail:liuweixin@163.com。

R735.7

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1008-0104(2015)01-0078-02

2014-09-09)