山羊痘疫苗熒光定量效檢方法的建立及應用

張倩,唐娜,2,王金良,2,苗立中,2,胡琳琳,孫翠萍,沈志強,2*

1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州256600

2.濱州畜牧獸醫研究院,山東濱州256600

山羊痘疫苗熒光定量效檢方法的建立及應用

張倩1,唐娜1,2,王金良1,2,苗立中1,2,胡琳琳1,孫翠萍1,沈志強1,2*

1.山東綠都生物科技有限公司,山東濱州256600

2.濱州畜牧獸醫研究院,山東濱州256600

為建立靈敏度高，特異性強的山羊痘（GPV）熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測方法，并以穩定的標準品替代定量測定山羊痘疫苗半成品中的核酸。針對山羊痘病毒基因組P32基因設計一對特異性引物，構建穩定的標準品，進行敏感性、特異性和穩定性試驗，并對本單位的部分批次山羊痘疫苗半成品進行定量檢驗，與TCID50效檢結果相比較尋求相關性。結果表明建立的標準曲線相關系數為0.9995，擴增效率為98%，該方法只擴增山羊痘病毒，不擴增其他病原，能檢測到每微升體積中100個DNA模板拷貝數，比山羊痘普通PCR(GPV-nPCR)高一個數量級。制備三批標準品進行重復性試驗，結果變異系數在0.43～1.9%之間，穩定性良好。對4批的山羊痘疫苗半成品進行效力檢驗，TCID50≥104.5/mL時Ct值為14.51。建立的GPV-FQ-PCR方法能特異性的檢測GPV核酸含量，與TCID50測定的結果具有良好的相關性，可用于山羊痘半成品中核酸的定量測定。

山羊痘;疫苗;熒光定量;效力檢驗

山羊痘病毒（Goat pox virus，GPV)、綿羊痘病毒（Sheep pox virus,SPV）和疙瘩皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)同屬于羊痘病毒屬，山羊痘主要癥狀是皮膚和粘膜上出現痘疹和痘皰。該病的流行已有很長的歷史，主要分布于非洲、中東及中亞地區，對養羊業危害嚴重。該病發病迅速，羔羊死亡率高。該病被世界動物衛生組織(OIE)列為A類傳染病，我國將其列為一類動物疾病[1]。

熒光定量PCR（Fluorescent quantitation PCR,FQ-PCR）是在普通PCR的基礎上發展起來，熒光定量PCR相比于普通PCR具有更高靈敏度，并可精確定量，因此被廣泛的用于疾病的早期檢測和臨床組織樣品的定量檢測[2]。近年來因其可精確定量還被應用于替代疫苗半成品的效力檢驗，2006年蔣春燕等建立熒光定量PCR與豬瘟兔化弱毒苗的半成品的效力檢驗兔體定型熱反應相比較，建立的熒光定量檢測方法與兔體定型反應熱之間具有很好的相關性[3]，可用以豬瘟兔化弱毒苗的半成品的效力檢驗。2013年陳鍇等針對豬瘟兔化弱毒的3’端非編碼區設計了MGB探針熒光定量法，靈敏度更高，結果同樣適用于豬瘟兔化弱毒苗的半成品中豬瘟兔化弱毒的定量檢測[4]。

山羊痘目前的預防措施主要是免疫山羊痘弱毒疫苗進行保護，山羊痘AV41是目前國內主要的預防山羊痘的疫苗，在山羊痘的防控中發揮了重要的作用[5]。目前該疫苗的生產主要采用了原代綿羊羔睪丸細胞（Sheep testicular cells,STCs）[6]。同時也利用STCs進行效力檢驗。但是該原代細胞制備成本高，耗時長，并且受綿羊羔個體差異的影響而對檢驗結果造成一定的影響。

本研究研究針對山羊痘病毒P32基因建立了SYBGREENⅠ熒光實時定量檢測方法，構建穩定的標準品，以利用其敏感性高，特異性好，檢測成本低的特點，對疫苗半成品進行的效力檢驗。即可節約檢測成本，縮短檢測時間，提供快速準確的結果。同時該方法也可應用于山羊痘的早期診斷，為監測疫情的發展提供靈敏可靠的方法。

1 材料和方法

1.1 毒株,菌種和載體

山羊痘弱毒株病毒AV41由山東綠都生物可以有限公司提供；羊口瘡，羊胸膜肺炎病料由山東綠都生物科技有限公司實驗室保存。

1.2 主要儀器與試劑

SYBR Premix Ex TaqTM（PerfeCt Real Time）試劑盒、PrimeScript RT reagent試劑盒、Ex Taq聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1）、6×Loading Buffer、PMD-18T克隆試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；質粒小提試劑盒、多功能DNA純化回收試劑盒、DH5a購自北京百泰克生物技術有限公司；病毒RNA/DNA抽提試劑盒購自AXYGEN。

熒光定量PCR儀LightCycler?480購自羅氏；微量紫外分光光度計Nanodrop 2000/2000C購自賽默飛世爾科技；普通PCR儀T100型梯度PCR儀購自伯樂。

1.3 引物的設計

根據Genbank登錄的GPVHuB/2009/China株的膜蛋白p32基因(JN596275.1)序列，應用Primer Premier5.0設計一對特異性的引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物P1:5'-GCAA ATCGTATGCCGATGC-3'；下游引物P2:5'-CCGTCAGGAAATCtATGAGCC-3'，其PCR擴增產物為4 94 bp,用于構建標準質粒；熒光定量PCR引物R1:5'-CtCAAACtGGTAGAAATACCtTTAT-3'；R2:5'-GGATATGATTTTACCtTATCtGC-3'。產物長度為110 bp。

1.4 樣品處理與核酸提取

將凍干毒種樣品用無菌的生理鹽水稀釋至原體積，12000 r/min離心5 min，取200μL上清液，利用病毒RNA/DNA抽提試劑盒提取病毒核酸。

1.5 目的基因的擴增與標準質粒的構建

以提取的山羊痘疫苗的DNA作為模板使用設計的引物P1、P2擴增目的基因片段。擴增體系：2×Premix Taq 10 μL、上下游引物（10 μM）各1 μL、DNA模板2 μL、滅菌雙蒸水6 μL。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定。膠回收目的片段用以構建標準質粒。挑取菌落篩選陽性克隆，用微量紫外分光光度計測定質粒的濃度與純度，送生工生物工程（上海）有限公司測序，測序結果與GenBank序列進行比對，-20℃保存備用。

1.6 標準曲線的建立及敏感性檢測

根據重組質粒的濃度，計算拷貝數濃度。計算公式為拷貝數=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)。將上述制備的標準樣品10倍倍比稀釋后，取1.0×102～1.0×108拷貝/μL的標準質粒分別進行熒光定量PCR和普通PCR，比較兩種方法的靈敏度。

1.7 特異性試驗和穩定性試驗

分別以山羊常見病山羊痘、羊口瘡、羊傳染性胸膜肺炎DNA為模板，進行熒光定量PCR反應以驗證該方法的特異性。

根據敏感性試驗的擴增動力曲線選取擴增效率高的六個稀釋梯度，進行穩定性試驗，制備三批標準品，將質粒的濃度稀釋到同樣濃度進行擴增試驗，比較建立標準曲線的穩定性。

1.8 在疫苗半成品效力檢驗中的應用及在臨床診斷上的應用

利用建立的山羊痘熒光定量方法，對四批已知病毒滴度的疫苗半成品進行提取病毒基因組后進行病毒含量檢測，與TCID50方法結果比對，分析結果的相關性。

利用建立的熒光定量的方法，對本公司新引進的山羊進行山羊痘篩選，無明顯病變特征的羊采集口鼻粘液作為組織樣本，出現疑似皮膚痘腫的同時采集皮膚組織及口鼻粘液，利用試劑盒提取組織樣本中提取病毒基因組，進行熒光定量PCR檢測。

2 結果

2.1 PCR擴增及質粒的構建

經PCR擴增鑒定，與預期的目的條帶相一致（如圖1）。將目的片段與載體重組后，進行鑒定篩選陽性克隆，酶切后目的條帶的大小與預期的一致。陽性質粒經測序后與Genbank中公布的GPV基因序列進行同源性比較，其核苷酸同源性在99%以上，表明重組質粒序列正確。經微量紫外分光光度計測定質粒濃度為175.36 ng/μL，依據基因拷貝數計算公式（基因拷貝數=DNA質量濃度/DNA分子量）測得質粒拷貝數為個5.3x1010拷貝/μL。

圖1 GPV基因擴增M:DL2000DNA;1:陰性對照組;2目的基因Fig.1 PCR amplification of GPVM:DL2000DNA;1:Negative control;2:Target gene

2.3 標準曲線的建立及敏感性檢測

用TE將標準陽性重組質粒首先進行530倍的稀釋，稀釋終濃度為108拷貝/μL，然后進行10倍的倍比稀釋，取102～108拷貝/μL的7個稀釋梯度作為模板進行熒光定量PCR擴增，生成動力學曲線（圖2)和標準曲線（圖3），Ct值和標準質粒濃度間呈現良好的線性關系，動力學曲線的擴增效率為98%，

標準曲線斜率為-3.3693，線性方程為y=-3.3693x+34.349，相關系數為0.9995（圖3）。溶解曲線倒數圖中（圖4）有單一清晰的峰，引物擴增特異性好無引物二聚體等非特異性擴增片段。

圖2 標準質粒倍比稀釋擴增動力曲線Fig.2 Dynamic amplification curves of standard plasmid dilution1-7:依次為倍比稀釋質粒濃度108～102拷貝/μL1-7:The curves 1 to 7 represent the plasmid concentration 108～102copy/μL diluted in double

圖3 標準曲線線性回歸分析Fig.3 Linear regression analysis of the standard curve

圖4 溶解曲線Fig.4 Dissolution curve

圖5 普通PCR凝膠電泳鑒定結果Fig.5 Agarose gel eletrophoresis result of common PCR1-7:依次為倍比稀釋質粒濃度108～102/μL1-7:The curves 1 to 7 represent the plasmid concentration 108～102copy/μL diluted in double

將10倍系列稀釋的標準質粒同時進行了普通PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果見圖5。結果表明GPV-nPCR檢測到標準質粒拷貝濃度為1000拷貝/μL為最低的檢測度，而圖2結果表明GPV-FQ-PCR的檢測到的質粒拷貝濃度為100拷貝/μL。熒光定量的靈敏度優于普通PCR。

2.4 特異性試驗與穩定性試驗

山羊痘、羊口瘡，羊傳染性胸膜肺炎DNA作為模板，進行熒光定量PCR反應，結果發現除山羊痘能夠擴增出S型動力曲線，其它病毒均不擴增。溶解曲線無非特異性產物和引物二聚體的峰值出現，表明所建立的方法具有很好的特異性（圖6），與其它山羊常見病原核酸無交叉反應。

圖6 特異性檢測擴增曲線Fig.6 The specific experiment of FQ-PCR assay

選取擴增效率高的六個稀釋梯度，進行穩定性試驗，制備三批標準品BZ1、BZ2、BZ3，將三批標準質粒的濃度稀釋到同樣濃度進行擴增試驗，比較建立標準曲線的穩定性。表1的結果表明三批標準質粒的變異系數在0.43～1.90%之間，表明我們建立的標準品重復性好，檢測結果穩定（表1）。

表1 標準品穩定試驗結果Table 1 Test results of standard stability

2.5 在疫苗半成品中的效價監測上的應用及在臨床診斷上的應用

利用建立的標準品對四批山羊痘半成品進行檢測并與TCID50的結果相比較，TCID50≥104.5時判定為合格，檢測結果表明GPV01為最低合格標準，其病毒含量為7.93×105(表2)。

表2 山羊痘半成品效力檢測Table 2 Efficacy test of GPV semi-finished products

臨床早期診斷，對新引入的羊群篩選，其中兩只疑似皮膚痘腫的山羊均檢測為山羊痘陽性，三份鼻腔粘液檢測為陽性，痘腫皮膚與鼻腔粘液檢測結果相符合，將皮膚無痘腫，鼻腔粘液檢測為陽性的山羊隔離，該羊三天后皮膚出現痘腫，檢測普通PCR檢測為陽性。

3 討論

熒光定量PCR是20世紀90年代美國AppLied Bisosystems公司率先推出的的一種新型的核酸定量技術，與普通PCR相比其直觀性強，可以監督整個反應，又因其特異性強、敏感性好、精確性高被廣泛的用于疾病的診斷、基因的監測、免疫分析等多個領域[7,8]。

山羊痘的疫苗的效力檢測用細胞為綿羊羔睪丸原代細胞，該細胞獲得難度大成本高，并且細胞活力受山羊的體重、月齡等因素影響致使效力檢測結果不穩定，不能對病毒的毒價進行準確的定量。近年來熒光定量技術因其可精確定量的特點被用以疫苗半成品的效力檢驗，韓劍鋒等建立H5亞型禽流感病毒滅活疫苗中病毒核酸的定量檢測方法,分析其與HI抗體效價之間的相關性，探索禽流感滅活疫苗效力體外檢驗的方法[9]。陳鍇等建立的熒光定量檢測方法以替代豬瘟兔化弱毒苗的傳統效力檢驗，快速準確的對疫苗半成品進行定量[4]。本研究將熒光定量的檢測結果與細胞效力檢測結果相比較，建立穩定的相關性，使其替代傳統的檢測方式，對疫苗半成品進行效力檢測，可快速的淘汰不合格產品，降低檢測成本。我們檢測本次合格的檢測Ct值為14.51，這與標準品稀釋為106拷貝數/μL時的Ct值相近，為了避免因為標準品不同批次間產生的誤差，我們定為每次檢測的半成品的Ct值≥106拷貝數/μL標準品時，即判為合格，若是小于該值時，則需通過TCID50進行復核效檢。

羊痘病毒屬的成員之間的基因的同源性高達96%，血清學無明顯的交叉反應，三種病毒的劃分主要是依據易感宿主劃分[10]，本研究針對山羊痘病毒P32基因設計熒光定量PCR方法可同時用于該病毒屬的臨床診斷。程振濤等從利用探針法比臨床診斷提早5 d從鼻腔分泌液中檢測到了病毒粒子[11]。我們從新引入羊場的羊群中采集鼻腔粘液進行山羊痘篩選，同時對出現疑似皮膚痘腫的進行組織采集，兩只疑似皮膚痘腫的山羊均檢測為山羊痘陽性，鼻腔粘液檢測均為陽性，該羊與羊群隔離后三天出現皮膚痘腫。結果表明本研究建立的熒光定量PCR作為羊痘的早期診斷，用于臨床的疾病快速篩選。

4 結論

本研究成功建立了山羊痘熒光定量檢測方法，即可用于疫苗半成品中病毒的精確定量用以替代半成品效力檢驗，同時也可用于臨床山羊痘的早期診斷，及早確診患病羊及時隔離建立健康羊群，為山羊痘疫病的控制提供重要的檢測手段。

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Establishment and Application of Fluorescent Quantitation Efficacy Test for Vaccine of Goat Pox Virus

ZHANG Qian1,TANG Na1,2,WANG Jin-liang1,2,MIAO Li-zhong2,HU Lin-lin1, SUN Cui-ping1,SHEN Zhi-qiang1,2*
1.Shandong Lvdu Bio-Science&Technology Co.Ltd,Binzhou256600,China
2.Shandong Binzhou Animal Science&Veterinary Medicine Academy,Binzhou256600,China

To establish a sensitive and specific fluorescent quantitation PCR(FQ-PCR)determination method for goat pox virus(GPV)and to find a stable measurement standard sample as an alternative for efficacy test.A pair of primers was designed for GPV P32 gene to construct the standard plasma and test for sensitivity,specificity and stability.GPV-FQ-PCR was applied to detect semi-finished products of the vaccine and to compare with TCID50.The results showed that correlation coefficient of the standard curve was 0.9995,the amplification efficiency was 98%.The method only amplified goat pox viruses rather than other pathogens.The least copy number of high sensitivity detection in the template DNA was 100/μL. Three batches of standard samples were used in preparation.Variation coefficients were very stable between 0.43-1.9%.Ct value was 14.51 when TCID50≥104.5/mL in four batches of goat pox vaccine semi-finished products test.Established GPV-FQ-PCR method specifically detects nucleic acid of GPV,there is a correlation with the results of TCID50and could be used for semi-finished products efficacy test of GPV vaccine.

GPV;vaccine;fluorescent quantitation PCR(FQ-PCR);efficacy test

S8

:A

:1000-2324(2015)06-0865-05

2013-10-17

:2013-12-04

山東省現代農業產業技術體系羊創新團隊(SDAIT09-011-07)

張倩(1984-),女,碩士,主要從事預防獸醫學.E-mail:zqnew.shd@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:bzshenzq@163.com