農業院校高水平運動員腸道菌群區系與身體素質的關系探討

劉志剛,馮海峰,莊俊濤,劉勉

山東農業大學體育與藝術學院,山東泰安271018

農業院校高水平運動員腸道菌群區系與身體素質的關系探討

劉志剛,馮海峰,莊俊濤,劉勉

山東農業大學體育與藝術學院,山東泰安271018

為研究農業院校高水平運動員腸道菌群區系與身體素質的關系，解決運動性胃腸綜合征問題，提高運動員的競技水平，通過采集山東農大不同來源運動員的新鮮糞樣，對胃腸道正常菌群進行分離鑒定，并對分離的優勢菌乳酸桿菌進行16 SrRNA分析；同時將正常菌群優勢菌研制成口服液，安全性檢測合格后用于受試者，連續服用10 d，每日1次，觀察運動員胃腸道菌群的變化及其與身體素質的關系。結果表明：運動員腸道中的優勢菌群為乳酸桿菌、雙歧桿菌、消化球菌和腸球菌，且異性之間腸道正常菌群平均值差異顯著（P＜0.05），同性不同區域之間差異不顯著（P＞0.05）；對4株乳酸桿菌嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus、卷曲乳桿菌Lactobacillus crispatus、鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus和唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius16SrRNA檢測分析，并與Genbank上公布的序列分析，同源性分別為99.2%，99.1%，99.8%和98.9%。受試運動員服用微生態制劑后，胃腸功能、運動持久力、抗感冒的能力均明顯增強，抗疲勞能力增強0.7～1.1 h。由此可見運動員腸道菌群區系與身體素質關系密切，堅持服用微生態制劑可以明顯提高運動員的運動能力，解決運動性胃腸綜合征問題，為提高運動員的水平提供理論依據。

農業院校;運動員;腸道;正常菌群;微生態制劑;身體素質

人體是一個復雜的有機體，各個功能系統之間都是相輔相成，密切聯系的。應激反應是不斷變化的外界條件所引起的機體功能狀態的適應性變化。在某種意義上，人體的胃腸道也是控制和調節運動員適應和再生能力系統的一部分。平衡的胃腸免疫系統以及積極的免疫活性可以使運動員抵御有害病原體的侵害。在運動過程中，機體所發生的一系列的變化將會導致胃腸系統的功能及其結構的變化，降低胃腸道對體液及營養物質的吸收，導致脫水和能量貯存不足，從而影響運動員的運動能力。

近年來，隨著高校高水平運動員的增多，鍛煉項目及鍛煉強度的增加，運動員常常出現運動后身體不適，尤其是胃腸功能的問題[1]。人們己經很多地了解到有關體育運動對心肺功能及內分泌系統的影響，而體育運動與胃腸微生物區系的關系卻知之甚少。胃腸道微生物對維持人類健康起著重要作用，而且與胃腸綜合征的發病有著一定的聯系[2,3]。經常從事體育鍛煉，對胃腸道的機能有良好影響，可以使胃腸的蠕動增強，消化液的分泌增多，因而提高了消化和吸收的能力，使人的食欲增加，有利于增強體質。但是，劇烈的緊張性運動則會導致胃腸功能紊亂，引起嘔吐、腹瀉等不良癥狀，這在運動員，尤其是耐力運動員中尤為常見。運動員腸道微生物菌群結構的研究將會給運動性胃腸綜合征發生機制的研究提供許多有價值的信息和思路[4-7]。本研究以山東農業大學高水平運動員為研究對象，目的在于探索高水平運動員胃腸道微生物區系與人體素質的關系，解決運動性胃腸綜合征問題，為提高運動員的水平提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

恒溫培養箱（WS2-134-65,HH B11 420），上海市躍進醫療器械一廠生產；厭氧菌培養箱（YQX-II），上海康華生化儀器制造廠生產；光學顯微鏡（OLYMPUS,CH-2），JAPAN生產；電子天平(asleep EY-300A),JAPAN生產；微量移液器，德國Eppendorf公司生產。

1.2 主要試劑

革蘭氏染色液，微量生化反應管，上海醫學化學試劑廠生產；FS、ES、PS、BLb、MRS、BDS、EC、SP、Emb等培養基購自天津東方衛生材料廠；硝酸鹽還原培養基、明膠液化培養基、蛋白胨水培養基、硫化氫試驗培養基購自上海生物工程公司。

1.3 運動員胃腸道正常菌群的分離鑒定

采用隨機抽樣的方法，抽取山東農大高水平運動員40名(其中男女各20名)，在其訓練前，分別采集1克新鮮糞樣，按常規細菌分離培養方法進行細菌分離并鑒定。

1.4 運動員胃腸道微生物優勢菌16SrRNA分析

采用隨機抽樣的方法，抽取山東農大運動員(其中男女各10名)，在其訓練前后，分別采集1 g新鮮糞樣，并對樣品進行預處理，提取細菌總DNA，以細菌總DNA為模板，16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，上游引物：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR反應體系為25 μL，即ddH2O 16 μL、10×buffer 2.5 μL、MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、上下游引物各0.5 μL(引物濃度為25 pmol/μL)、模板1.0 μL、酶0.5 μL。PCR反應條件為：94℃預變性4 min，然后進入94℃變性30 s、56.0℃退火30 s和72℃延伸2 min，30個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物經與pMD18-T載體連接，轉化感受態大腸桿菌，重組質粒鑒定為陽性的送南京金斯瑞科技有限公司測序，將所得到的序列與Genbank中的16S rDNA序列進行分析比較。

1.5 益微生態制劑對運動員身體素質的增強作用

將分離獲得的胃腸道正常菌群通過比較分析，篩選優勢菌株，經一定工藝研制成微生態制劑口服液。為了確定受試運動員服用微生態制劑口服液的胃腸功能、運動持久力（抗疲勞能力）、抵抗感冒能力，由教練制定訓練計劃，使受試者完成定量的運動負荷，通過對照服用微生態制劑前后，受試者對同樣強度的疲勞運動負荷一系列生理生化反應，觀察微生態制劑口服液的抗疲勞效果，試驗組受試者服用10 d微生態制劑，每日1次，午餐前服用，比較服用微生態制劑前后同一組運動員的身體素質的變化。

2 結果

2.1 高水平運動員腸道菌群鑒定結果

2.1.1 選擇性培養基上的菌落特征觀察選擇性培養基上的菌落特征（見圖1），結合楊景云(1997)報道的鑒定方法，根據各菌落的特征初步對其菌屬進行確定，結果見表1。

2.1.2 選擇性培養基上細菌的形態特征挑取選擇性培養基上目的菌進行革蘭氏染色，鏡檢觀察，參考東秀珠（2001）的鑒定方法，對挑取細菌的形態特征進行對照，進一步對菌屬進行確定，結果見表2。

圖1 各種細菌在選擇性培養基上菌落的形態Fig.1 Colony morphology of bacteria on selective medium

表1 各選擇性培養基上菌落的特征Table 1 Colony characteristics of bacteria on seclective medium

表2 選擇性培養基上細菌的形態特征Table 2 Characteristics of bacteria on seclective medium

2.1.3 選擇性培養基上細菌的生化特征將選擇性培養基上分離到的各種細菌純培養之后，分別進行生化試驗，結果見表3。

表3 各種細菌的主要生化特征Table 3 The main biochemical characteristics of various bacteria

2.2 不同來源運動員糞便中正常菌群的數量

對抽取的山東農大運動員來自農村和城市男女各10名，檢測的正常菌群的數量見表4。

表4 不同來源運動員糞便中正常菌群的數量(nlog10/g糞樣)Table 4 The number of normal flora in feces of different athletes(nlog10/g feces)

由表4分析，運動員腸道中的優勢菌群為乳酸桿菌、雙歧桿菌、消化球菌和腸球菌；運動員腸道正常菌群經統計學分析10名來自城市的男運動員平均值與10名來自城市的女運動員平均值及10名來自農村的女運動員平均值差異顯著（P＞0.05），與10名來自農村的男運動員平均值差異不顯著（P〉0.05）；10名來自農村的男運動員腸道正常菌群平均值與10名來自城市的女運動員平均值及10名來自農村的女運動員平均值差異顯著（P＞0.05）。

2.3 運動員胃腸道優勢菌16SrRNA結果

2.3.1 分離菌的16S rRNA鑒定結果由圖2表明，1～4菌株的16S rRNA基因序列長度均為1500 bp，與標準菌株相同。

圖2 分離菌株的16S rRNA基因擴增圖Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA geneM:Marker，1-4為SL-1、SL-2、SL-3和SL-4分離菌株，5為標準株（LB1）M:Marker;1-4 Lactobacilli isolate SL-1,SL-2,SL-3,SL-3 and SL-4; 5:Standard Lactobacilli DNA sample（LB1）

2.3.2 PCR產物測序結果將PCR產物測序，并在Genbank上進行Blast分析，結果顯示，SL-1、SL-2、SL-3、SL-4株分別屬于嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）和唾液乳桿菌（L.salivarius），它們的同源性分別為99.2%，99.1%，99.8%和98.9%。

2.4 微生態制劑口服液對運動員身體素質的增強作用

由表5可見運動員服用10 d后胃腸功能、運動持久力、抗感冒的能力明顯增強，能更好的適應運動帶來的應急反應，抗疲勞能力增強0.7～1.1 h，僅1例出現感冒現象。

表5 益生菌制劑的研制及其對運動員身體素質的增強作用Table 5 The development and enhancement on athletes'physical quality of probiotics

3 討論

近年來，隨著全民健身計劃的實施，體育運動已經以不同的形式在社會中廣泛流行，尤其是在具有健康意識的群體中。有關體育運動對心肺功能及內分泌系統的影響人們己經有了很多的了解，而體育運動對胃腸微生物區系的影響人們卻知之甚少。經常從事體育鍛煉，對胃腸道的機能有良好影響，可以使胃腸的蠕動增強，消化液的分泌增多，因而提高了消化和吸收的能力，使人的食欲增加，有利于增強體質。但是隨著體育競技運動水平的不斷提高，勢必要求有高水平的運動訓練。運動性胃腸綜合征是運動員在高強度、大運動量的運動訓練和比賽中造成的機體胃腸功能紊亂的現象，而且也不同程度地妨礙了運動員正常的運動訓練和比賽。本研究對抽取的山東農大運動員腸道的正常菌群進行分離鑒定，對定植在胃腸道內的正常微生物區系進行研究，結果發現運動員腸道中的優勢菌群為乳酸桿菌、雙歧桿菌、消化球菌和腸球菌，對其腸道正常菌群進行統計，結果顯示男運動員腸道正常菌群的平均值顯著高于女運動員平均值，可見性別不同的運動員腸道正常菌群的平均值差異顯著；10名來自城市的男運動員腸道正常菌群平均值與10名來自農村的男運動員腸道正常菌群平均值，以及10名來自城市的女運動員腸道正常菌群平均值與10名來自農村的女運動員腸道正常菌群平均值差異不顯著（P＞0.05），可見地區來源不同的運動員平均值差異不顯著（P＞0.05）；10名來自城市的女運動員平均值與10名來自農村的女運動員平均值差異顯著（P＜0.05）。

近年來，隨著微生物生態學的發展，人們注意到定植在胃腸道內微生物菌群區系結構，這個區系主要是由許多細菌組成，它們附著在腸內粘膜上，參與了機體的食物消化、藥物代謝、合成維生素和防止外源致病菌入侵腸道，對于維持人類的健康和實現各種生理功能起著非常重要的作用。人體腸道內這些微生物與人體胃腸的功能關系密切[5,7,8]。在研究運動員胃腸功能的變化時，胃腸道的微生物區系是不容忽視的因素[8,9]。通過運動員口服微生態制劑來研究微生態制劑對運動員身體素質的增強作用，結果發現農業大學運動員口服微生態制劑后明顯增強了運動員的抗應急、抗疲勞、抗感冒的能力，可見運動員腸道菌群區系與身體素質關系密切，堅持服用微生態制劑可以明顯提高運動員的運動能力。這一研究結果不僅有助于解決運動性胃腸綜合征問題，進一步闡明運動性胃腸綜合征的發病機制，了解和掌握運動中胃腸功能變化的規律，科學地指導體育訓練，促進我國競技體育的發展，而且還將為我國全民健身計劃的開展實施提供科學的指導依據。

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The Exploration for the Relationship between Intestinal Flora and Physical Quality of the High-level Athletes in Agricultural Universities

LIU Zhi-gang,FENG Hai-feng,ZHUANG Jun-tao,LIU Mian
Sports and Art College of Shandong Agricultural University,Taian271018,China

For studying Agricultural universities’high-level athletes intestinal flora fauna and physical relationship,solving the problem of gastrointestinal motility syndrome,improving the competitive level of athletes,we collect the fresh fecal samples of athletes from Shandong Agricultural University to isolate and identify the normal flora of the gastrointestinal tract. Lactobacillus,the normal flora dominant bacteria are conducted for 16SrRNA analysis and developed into oral liquid.After safety testing,it used to subjects,taking for 10 days,once a day before lunch,observe the relationship between the changes in athletes’gastrointestinal flora and their physical quality.The results show that the dominant flora in athletes’intestinal are Lactobacillus,Bifidobacterium,Peptococcus and Enterococcus,and the average of normal intestinal flora between heterosexual has a significant difference(P＞0.05),but the difference between different regions of the same sex is not significant(P＞0.05).The four strains ofLactobacillus acidophilus、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus rhamnosusandLactobacillus salivariusare conducted for 16SrRNA detection and analysis and compare with the sequence in Genbank:the homology are 99.2%,99.1%,99.8%and 98.9%.After taking probiotics,the gastrointestinal function,exercise endurance and the ability to anti-cold of tested athletes are all enhanced significantly.Besides,the resistance to fatigue is enhanced for0.7-1.1 h.Those show that the intestinal flora fauna of athletes and their physical quality have a close relation.Insisting on taking probiotics can improve the athletes’athletic ability significantly and solve the problem of gastrointestinal motility syndrome.Besides,it can provide a theoretical basis for improving the level of athletes.

Agricultural universities;athletes;intestinal tract;normal flora;probiotics;physical quality

R378.2

:A

:1000-2324(2015)06-0874-06

2013-04-11

:2013-04-25

山東星火計劃項目(2008XH080)

劉志剛(1958-),男,副教授,研究方向為陽光體育及足球運動.E-mail:yh1368@sdau.edu.cn