新疆地區維吾爾族和漢族晚期非小細胞肺癌患者三磷酸腺苷結合盒轉運體C2基因多態性差異研究

韓志剛，陶潔，王強，單莉

·論著·

新疆地區維吾爾族和漢族晚期非小細胞肺癌患者三磷酸腺苷結合盒轉運體C2基因多態性差異研究

韓志剛，陶潔，王強，單莉

目的探討新疆地區維吾爾族和漢族晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者三磷酸腺苷結合盒轉運體C2 (ABCC2)基因多態性差異。方法選擇2013年3月—2014年8月就診于新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內一科的晚期NSCLC患者226例，其中維吾爾族110例(A組)，漢族116例(B組)，采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應檢測ABCC2基因rs717620、rs2273697、rs3740066位點多態性。結果兩組患者ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率比較，差異均有統計學意義(P＜0.05);而兩組患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位點基因型及等位基因分布頻率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。兩組腺癌患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。兩組鱗癌患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。兩組ⅢB、Ⅳ期患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論新疆地區維吾爾族、漢族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位點多態性無明顯差異，而rs717620位點多態性存在差異。

癌，晚期非小細胞肺;三磷酸腺苷結合盒轉運體C2;基因多態性;維吾爾族;漢族

韓志剛，陶潔，王強，等.新疆地區維吾爾族和漢族晚期非小細胞肺癌患者三磷酸腺苷結合盒轉運體C2基因多態性差異研究［J］.實用心腦肺血管病雜志，2015，23(3):38－42.［www.syxnf.net］

Han ZG，Tao J，Wang Q，et al.Differences of genetic polymorphisms of gene ABCC2 between Uygur and Han patients with advanced non－small cell lung cancer in Xinjiang［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(3):38－42.

三磷酸腺苷結合盒轉運體C2(ABCC2)又名多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance－associated protein 2，MRP2)或小管多種有機陰離子轉運體(canalicular multispecific organic anion transporter，cMOAT)，其是一種膜轉運蛋白，屬于ABC轉運體中C亞家族中的一員。人類ABCC2基因定位于染色體10q24，共有32個外顯子，在基因組DNA中長度約200 kb;ABCC2蛋白質由1 545個氨基酸組成，含有17個跨膜螺旋結構，構成了3個跨膜結構域。ABCC2具有阻止化療藥物進入細胞內的作用，是藥物代謝轉運通路中的主要基因，其機制與ABCC2自身的生物學作用有關，ABCC2把藥物從細胞內泵出細胞以降低細胞內藥物濃度和減輕細胞毒性作用，進而使機體對鉑類等藥物產生耐藥。Ito等［1］研究發現，ABCC2基因的6個變異中C－24T、G1249A和C3972T等位基因分布頻率分別是18.8%、12.5%和21.9%，因其分布頻率較高而成為ABCC2基因多態性研究的重點，另外3個變異(C2302T、C2366T和G4348A)的分布頻率均小于1%。因此，本研究選擇ABCC2基因rs717620、rs2273697、rs3740066位點進行多態性分析，探討其在新疆地區維吾爾族、漢族晚期非小細胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)患者中的分布特征，旨在為后續有關不同民族NSCLC的治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年3月—2014年8月就診于新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內一科的晚期NSCLC患者226例，均經病理檢查確診，其中維吾爾族110例(A組)和漢族116例(B組)，兩組患者性別、年齡、病理類型、TNM分期及吸煙率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05，見表1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要實驗儀器及試劑聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀(加拿大BBI公司);SW－CJ－1D潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設備廠);DK－8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司);DYY－8型穩壓穩流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司);YXJ－2離心機(湘儀離心機儀器有限公司);H6－1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠);凝膠成像系統(Gene Genius公司);U－3010紫外－可見分光光度計(Hitachi公司);移液器(范圍100～1 000 L，20～200 L，0.5～10 L)(加拿大BBI公司);Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer〔無Mg2+:100 mM Tris－HCl，pH值8.8，25℃;500 mM KCl，0.8%(v/v)Nonidet〕; MgCl2(25 mM)、蒸餾水(dH2O)(10 mM)、Marker (BBI)、6×DNA Loading Dye(上海生工);PCR產物純化回收試劑盒(上海生工SK1141);限制性內切酶(MBI)。

表1 兩組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information between two groups

1.2.2 DNA提取及PCR擴增抽取226例晚期NSCLC患者外周靜脈血3 ml加入EDTA抗凝試管內，全血于－80℃低溫冰箱保存備用。應用全血DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取DNA。采用PCR擴增儀擴增DNA，所用ABCC2基因引物序列見表2。PCR反應體系15 μl中含10×PCR Buffer 1.5 μl，引物F 0.2 μl，引物R 0.2μl，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.4 μl，Taq DNA聚合酶0.1 μl，dH2O 11 μl。PCR反應條件:95℃預變性5 min，95℃30 s，68℃45 s，72℃60 s，共20個循環;95℃30 s，58℃30 s，72℃40 s，共20個循環;72℃延伸7 min。

1.2.3 酶切分型采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應(PCR－RFLP)檢測ABCC2基因rs717620、rs2273697、rs3740066位點多態性。rs717620、rs3740066采用TaqI酶切分型，15 μl反應體系中包括PCR反應產物10 μl，10×Buffer R 1.5 μl，TaqI限制性內切酶0.1 μl，dH2O 3.4 μl，7℃水浴12 h，質量分數3%瓊脂糖凝膠，150 V電泳30 min，然后觀察DNA條帶。rs2273697采用NcoI酶切分型，15 μl反應體系中包括PCR反應產物10 μl，10×Buffer R 1.5 μl，NcoI限制性內切酶0.1 μl，dH2O 3.4 μl，7℃水浴12 h，質量分數3%瓊脂糖凝膠，150 V電泳30 min，然后分析酶切產物。

1.3 統計學方法應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，采用Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗樣本的群體代表性;組間基因型及等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗，以OR(95%CI)表示基因突變率差異;計量資料以(x±s)表示，采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗兩組患者ABCC2基因rs717620位點基因型分布頻率符合Hardy－Weinberg遺傳平衡(χ2=2.238，P=0.327;χ2= 0.665，P=0.717)，rs2273697位點基因型分布頻率符合Hardy－Weinberg遺傳平衡(χ2=0.015，P=0.992; χ2=0.331，P=0.848)，rs3740066位點基因型分布頻率也符合Hardy－Weinberg遺傳平衡(χ2=0.512，P= 0.774;χ2=0.405，P=0.817)，表明研究對象的選擇無遺傳學偏移，該群體基因遺傳平衡，具有較好的群體代表性。

2.2 ABCC2基因分型

2.2.1 ABCC2基因rs717620位點PCR擴增產物片段長度為139 bp，CC基因型為野生純合子，可見100 bp、39 bp兩種片段;CT基因型為雜合子，可見139 bp、100 bp、39 bp 3種片段;TT基因型為突變純合子，可見139 bp一種片段(見圖1)。

圖1 ABCC2基因rs717620位點基因多態性PCR－RFLP電泳圖Figure 1 PCR－RFLP electrophoresis of polymorphism of ABCC2 gene rs717620

2.2.2 ABCC2基因rs2273697位點PCR擴增產物片段長度為239 bp，GG基因型為野生純合子，可見239 bp、95 bp兩種片段;AG基因型為雜合子，可見239 bp、95 bp、69 bp、26 bp 4種片段，AA基因型為突變純合子，可見239bp、69bp、26bp 3種片段(見圖2)。

2.2.3 ABCC2基因rs3740066位點PCR擴增產物片段長度為132 bp，CC基因型為野生純合子，可見90 bp、42 bp兩種片段;CT基因型為雜合子，可見132 bp、90 bp、42 bp 3種片段;TT基因型為突變純合子，可見132 bp一種片段(見圖3)。

圖2 ABCC2基因rs2273697位點基因多態性PCR－RFLP電泳圖Figure 2 PCR－RFLP electrophoresis of polymorphism of ABCC2 gene rs2273697

圖3 ABCC2基因rs3740066位點多態性PCR－RFLP電泳圖Figure 3 PCR－RFLP electrophoresis of polymorphism of ABCC2 gene rs3740066

2.3 兩組患者基因型分布因ABCC2基因各位點突變純合子基因型例數較少，且突變純合子和雜合子均屬于突變基因型，因此將其與雜合子型合并。兩組患者ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率比較，差異均有統計學意義(P＜0.05);而兩組患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位點基因型及等位基因分布頻率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05，見表3)。

表3 兩組患者ABCC2基因rs717620、rs2273697和rs3740066位點基因型及等位基因分布頻率比較〔n(%)〕Table 3 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620，rs2273697 and rs3740066 between the two groups

2.4 兩組不同病理類型患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較兩組腺癌患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異有統計學意義(P＜0.05，見表4)。兩組鱗癌患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義(P＞0.05，見表5)。

表4 兩組腺癌患者ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率比較Table 4 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patients with adenocarcinoma between the two groups

表5 兩組鱗癌患者ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率比較〔n(%)〕Table 5 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patients with squamous carcinomas between the two groups

2.5 兩組不同TNM分期患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較兩組ⅢB、Ⅳ期患者ABCC2基因rs717620位點基因型和等位基因分布頻率比較，差異均有統計學意義(P＜0.05，見表6～7)。

表6 兩組ⅢB期患者ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率比較〔n(%)〕Table 6 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patients withⅢB stage between the two groups

表7 兩組Ⅳ期患者ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率比較〔n(%)〕Table 7 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patient withⅣstage between the two groups

3 討論

多藥耐藥相關蛋白亞家族中的ABCC2主要分布于肝細胞的管腔(頂)膜和腎近端小管細胞的管腔膜側，還有少部分位于腸道、膽囊上皮細胞、胚胎及血－腦脊液屏障的內皮細胞等極性細胞的頂膜［2］。ABCC2在藥物吸收、分布和排泄過程中具有非常重要的作用，通過其底物激活三磷酸腺苷酶水解ATP獲得能量，以主動轉運的形式將底物從細胞內泵出而轉運物質。ABCC2基因存在遺傳變異，其多態性同樣可影響編碼蛋白的表達和功能。當基因突變導致ABCC2發生氨基酸替換(lys325Met，Arg586Leu)時，這一作用減弱，細胞對鉑類藥物敏感性增強。該基因還可能通過促進GSH結合的鉑類藥物排出細胞外而增強腫瘤細胞對鉑類藥物的耐藥性。同時其與長春新堿、足葉乙甙、阿霉素、表阿霉素等耐藥亦有關。國外有研究報道，ABCC2基因不同位點的突變可使淋巴瘤及急性淋巴細胞白血病患者對甲氨喋呤化療效果產生影響［3－4］。

此外，Wada［5］研究發現，ABCC2基因某些位點的突變存在種族差異，截至目前為止，關于ABCC2基因突變位點的研究僅涉及日本人、高加索人和極少部分中

國人，關于維吾爾族人群該基因突變位點的基因分布頻率報道罕見。新疆作為少數民族聚居地區，地域遼闊，占據中國近1/6國土面積，其中維吾爾族人約占新疆總人口的45%以上。本研究發揮地域優勢首次對比分析新疆地區維吾爾族、漢族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs717620、rs2273697和rs3740066位點基因型及等位基因分布頻率的差異。本研究結果顯示，兩組患者年齡、性別、病理類型、TNM分期及吸煙率無明顯差異。基因分型清晰，符合Hardy－Weinberg遺傳平衡，結果較可靠。兩組患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位點基因型和等位基因分布頻率無明顯差異，ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率有差異。因此，針對該位點將兩組患者進行亞組分析，結果顯示腺癌亞組中ABCC2基因rs717620位點基因型及等位基因分布頻率有差異，漢族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs717620位點T等位基因分布頻率高于維吾爾族晚期NSCLC患者，而鱗癌亞組未見此差異。在TNM分期的亞組分析中發現，漢族ⅢB和Ⅳ期NSCLC患者ABCC2基因rs717620位點基因突變率均高于維吾爾族患者。表明不同遺傳異質性可導致不同人群、不同民族存在基因多態性差異，但研究地區不同、樣本選擇不同、樣本量不同及實驗方法不同同樣可引起基因多態性分布差異，這種現象的存在可能導致不同種族之間藥物處置及反應不同。

已有研究表明，維吾爾族晚期NSCLC患者的表皮生長因子受體(EGFR)突變率較低，與高加索人的肺癌突變率(7%～17%)相似［6］，因此使用EGFR－TKI靶向治療的患者數量有限，大部分患者還需行鉑二聯標準方案化療。在臨床觀察中發現，維吾爾族晚期NSCLC患者對肺癌化療效果低于漢族晚期NSCLC患者，但缺乏進一步的臨床數據及資料證明引起該種差異的原因。本研究結果顯示，漢族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs717620位點的突變率為27.6%，高于維吾爾族晚期NSCLC患者的11.8%，此位點突變率的高低是否影響漢族與維吾爾族晚期NSCLC患者對含鉑類聯合化療的臨床療效還需要進行深入研究。國內外已有多項研究證實，ABCC2基因rs717620位點突變能提高含鉑化療藥物治療晚期NSCLC患者的療效及延長其PFS［7－9］。但2012年Han等［10］研究發現，ABCC2基因C24T純合子NSCLC患者接受鉑類藥物治療的有效率較高〔OR (95%CI)=1.84(1.05，3.23)，P=0.032〕，與上述研究結果相互矛盾。這種差異可能與人群中復雜疾病遺傳異質性、化療方案不同及研究樣本量大小有關。

本研究初步探討了新疆地區維吾爾族、漢族晚期NSCLC患者ABCC2基因多態性差異，結果表明兩民族NSCLC患者ABCC2基因rs717620位點基因多態性存在差異，而是否由該種差異導致漢族晚期NSCLC患者較維吾爾族晚期NSCLC患者對含鉑化療方案較敏感還有待進一步研究證實，同時后續研究將繼續擴大樣本量確認該位點基因多態性在維吾爾族和漢族晚期NSCLC患者中的差異。

［1］Ito S，Ieiri I，Tanabe M，et al.Polymorphism of the ABC transporter genes，MDR1，ABCC1 and ABCC2 cMOAT，in healthy Japanese subjects［J］.Pharmacogenetics，2001，11(2):175－184.

［2］Ito K，Oleschuk CJ，Westlake C，et al.Mutation of Trp1254 in the multispecific organic anion transporter，multidrug resistance protein 2 (MRP2、ABCC2)，alters substrate specificity and results in loss of methotrexate transport activity［J］.J Biol Chem，2001，276(41): 38108－38114.

［3］Sharifi MJ，Bahoush G，Zaker F，et al.Association of－24CT，1249GA，and 3972CT ABCC2 gene polymorphisms with methotrexate serum levels and toxic side effects in children with acute lymphoblastic leukemia［J］.Pediatr Hematol Oncol，2014，31(2):169－177.

［4］Liu Y，Yin Y，Sheng Q，et al.Association of ABCC2－24C＞T polymorphism with high－dose methotrexate plasma concentrations and toxicities in childhood acute lymphoblastic leukemia［J］.PLoS One，2014，9(1):468－476.

［5］Wada M.Single nucleotide polymorphisms in ABCC2 and ABCB1 genes and their clinical impact in physiology and drug response［J］.Cancer Lett，2006，234(1):40－50.

［6］Kris MG，Johnson BE，Kwiatkowski DJ，et al.Identification of driver mutations in tumor specimens from 1000 patients with lung adenocarcinoma:TheNCI'sLungCancerMutationConsortium (LCMC)［C］.2011 ASCO Annual Meeting，2011:CRA7506.

［7］Han JY，Lim HS，Yoo YK，et al.Associations of ABCB1，ABCC2 and ABCG2polymorphisms with irinotecan pharmacokinetics and clinical outcome in patients with advanced non－small cell lung cancer［J］.Cancer，2007，110(1):138－147.

［8］Campa D，Muller P，Edler L，et al.A comprehensive study of polymorphisms in ABCB1，ABCC2 and ABCG2 and lung cancer chemotherapy response and prognosis［J］.Int J Cancer，2012，131 (12):2920－2928.

［9］Sun N，Sun X，Chen B，et al.MRP2 and GSTP1 polymorphisms and chemotherapy response in advanced non－small cell lung cancer［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2010，65(3):437－446.

［10］HanBH，GaoG，WuW，etal.AssociationofABCC2 polymorphisms with platinum－based chemotherapy response and severe toxicity in non－small cell lung cancer patients［J］.Lung Cancer，2011，72(2):238－243.

Differences of Genetic Polymorphisms of Gene ABCC2 between Uygur and Han Patients with Advanced Non－small Cell Lung Cancer in Xinjiang

HAN Zhi－gang，TAO Jie，WANG Qiang，et al．
The First Department of Respiratory Medicine，Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China

ObjectiveTo investigate the differences of genetic polymorphisms of gene ABCC2 between Uygur and Han patients with advanced non－small cell lung cancer(NSCLC)in Xinjiang.MethodsFrom March 2013 to August 2014，a total of 226 patients with advanced NSCLC were selected in the First Department of Respiratory Medicine，Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，and they were divided into groups A(Uygur nationality，n=110)and B(Han nationality，n=116)according to the nationalities.PCR－RFLP was used to detect the genetic polymorphisms of gene ABCC2，including rs717620，rs2273697 and rs3740066.ResultsThere were statistically significant differences of genotypes and allelic frequencies of rs717620 between the two groups(P＜0.05)，but no statistically significant differences of genotypes or allelic frequencies of rs2273697 or rs3740066 was found between the two groups(P＞0.05).There were statistically significant differences of genotypes and allelic frequencies of rs717620 of patients with adenocarcinoma between the two groups(P＜0.05)，but no statistically significant differences of genotypes or allelic frequencies of rs2273697 or rs3740066 of patients with squamous carcinoma was found between the two groups(P＞0.05).There were statistically significant differences of genotypes and allelic frequencies of rs717620 of patients withⅢB，Ⅳstage between the two groups(P＜0.05).ConclusionGenetic polymorphisms of gene ABCC2 rs717620 is different between Uygur and Han patients with advanced NSCLC in Xinjiang，but no obvious differences is found of genetic polymorphisms of gene ABCC2 rs2273697 or rs3740066.

Carcinoma，non－small－cell lung;ABCC2;Genetic polymorphisms;Uygur nationality; Han nationality

2基因引物序列 Table 2

基因正義鏈F反義鏈R ATAATTCCTGTTCCACTTTC 3' rs22736975'GCTGACACCAAAGGATAAATAGGAG 3'5'ACATCAGGTTCACTGTTTCTCCCA 3' rs37400665'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTCACCTACCTTCTCCATGCTATC 3'5'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTG rs7176205'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTCCTGGACTGCGTCTGGATC 3'5'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGGTAG TTTAACAACTACCAAGTGCGG 3'

R 730.26

A

10.3969/j.issn.1008－5971.2015.03.011

2014－11－16;

2015－03－08)

(本文編輯:謝武英)

新疆維吾爾自治區自然科學基金(2013211A074)

830011新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內一科

單莉，830011新疆烏魯木齊市，新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肺內一科;E－mail:1378213986@qq.com