胃黏膜損傷大鼠胃組織 P2X1、P2X3和P2X5的表達及電針對其影響

朱小香 鄭淑霞 薩喆燕 修春英 董亞琴 許金森

既往研究表明［1-3］，針刺足三里穴對胃黏膜損傷具有防治作用，然而其具體作用機制仍不清楚。上世紀70年代以來發現傳統的能量分子ATP也是一種神經遞質，其參與了從中樞到外周諸多組織細胞的生理生化機能。現代生物學對ATP及其受體P2X的研究成果為揭示針刺信號的轉換機制提供了充實的理論依據。目前研究發現P2X有P2X1-77個亞型，其中P2X1被認為與膀胱機能調節密切相關［4］。越來越多的研究證明P2X受體在胃腸道平滑肌的收縮和舒張中發揮著重要作用［5］，但具體亞型在其中所扮演的角色尚未完全清楚。胃和膀胱的共同特點之一是平滑肌都是其運動單元的一個重要組成部分，那么P2X1等亞型是否也在胃功能調節中起重要作用?另外，電針足三里穴治療胃黏膜損傷的作用機制是否與P2X受體亞型相關?為此，本文運用分子生物學方法從基因轉錄水平研究正常大鼠和胃黏膜應激損傷大鼠胃組織 P2X1、P2X3、P2X5亞型的表達情況以及電針足三里穴對其的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

成年SD雄性健康大鼠24只(福建醫科大學實驗動物中心提供，清潔級，許可證號:SCXK(閩)2012-0001。體重(250±25)g。動物稱重編號，隨機分為3組:正常對照組(正常組)、胃黏膜應激損傷模型組(模型組)、電針足三里穴組(電針組)各8只。

1.2 胃黏膜應激損傷模型制備

胃黏膜應激損傷大鼠模型制備采用冷-束縛應激法［6］并加以改良。造模方法:大鼠禁食不禁水24小時，束縛四肢于自制鐵板上，放入7℃冰箱，冷應激2.5小時后取出松綁。模型成功的標準:大鼠安靜，萎靡不振，身體蜷縮;形態學上動物胃黏膜有出血點和潰瘍灶。除正常組外，其余兩組大鼠均按冷-束縛應激法復制胃黏膜應激損傷模型。

1.3 干預方法

模型復制后，次日電針組給予電針治療:一次性無菌針灸針(0.18×13mm)直刺足三里穴1 cm(參考《實驗針灸學》大鼠針灸穴位圖譜定位［7］)，參考電極置于胃經線上足三里穴下0.5 cm處，疏密波，10/20Hz，刺激強度2～3 V，以下肢出現輕微抖動為度，電針20分鐘，連續三天。模型組和正常組均不進行電針干預。

1.4 主要試劑

總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒均為Promega生物公司產品;聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒為TIANGEN公司產品;引物由Invitrogen生物公司合成;GeneFinder染料為致善生物公司產品;DNA Marker為Bio Flux公司產品。

1.5 主要儀器

DU530核酸/蛋白分析儀(Beckman Coulter公司);Veriti PCR儀(ABI公司);Gene Genious生物成像系統(SYNGENE公司);WQ-IOD1電針儀(北京欣東華電子儀器有限公司)。

1.6 P2X亞型mRNA檢測

電針組治療結束后24小時以1%烏拉坦麻醉各組大鼠，剖腹取胃，沿胃大彎剪開、展平并用冰生理鹽水清洗胃內容物，全胃剪碎后置于預裝有100 μL總RNA提取裂解液的EP管中，液氮研磨后按Promega公司Z3100總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。然后核酸蛋白分析儀檢測RNA純度及濃度;取1μg總RNA，使用Promega公司A3500反轉錄試劑盒進行逆轉錄反應;取3μL逆轉錄產物進行P2X亞型的PCR反應，同時設置β-actin作內參照。大鼠P2X1上游引物5'-AAAGCAGAAAGGAAAGCCCA-3'，下游引物為 5’-ATACAGTCCGTGGAACTGG-3’，擴增片段長度為435 bp;P2X3上游引物5'-CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3'，下 游 引 物 為 5'-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3'，擴增片段長度為520 bp;P2X5上游引物5'-AGTCATCAACATTGGTTCTG-3'，下 游 引 物 為 5'-CAGGAGACCTTCCGTGAAA-3'，擴增片段長度為542 bp;β-actin上游引物為 5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，下游引物為 5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，擴增片段長度為240bp。PCR反應條件為:94℃預變性3分鐘→(94℃變性40秒，退火1分鐘，72℃延伸1分鐘)，共循環35次→72℃延伸10分鐘;退為溫度如下:P2X1為53℃，P2X3和P2X5前6個循環為53℃，后29個循環為48.5℃。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，使用生物成像系統對電泳條帶進行圖像采集和光密度值分析，目的基因與內參β-actin電泳條帶的光密度比值即為目的基因mRNA在組織中的相對表達量。

1.7 統計學處理

2 結果

各組大鼠胃組織均表達P2X1、P2X3、P2X5mRNA。經單因素方差分析LSD檢驗，模型組與正常組相比，大鼠胃組織P2X1mRNA表達顯著下降(P＜0.01);而電針組與模型組相比，大鼠胃組織P2X1mRNA表達顯著升高(P＜0.05)。P2X3、P2X5mRNA組間未見顯著差異。對正常組大鼠胃組織P2X1、P2X3、P2X5受體亞型作相關性分析，發現正常組大鼠胃組織P2X3和P2X5呈顯著正相關(P＜0.05，r(3，5)=0.755)。見表 1。

表1 各組大鼠胃組織P2X亞型mRNA的比較(，n=8)

表1 各組大鼠胃組織P2X亞型mRNA的比較(，n=8)

注:與正常組比較，a P＜0.01;與模型組比較，b P＜0.05。正常組3個亞型作相關性分析，P2X3與 P2X5顯著正相關，c P＜0.05，r(3，5)=0.755

-actin正常組 0.1789±0.0342 0.2473±0.0609c組別 P2X1/β-actin P2X3/β-actin P2X5/β 0.4485±0.0743 0.7851±0.0739 0.6653±0.0669模型組 0.0543±0.0274a 0.3293±0.1298 0.6853±0.1102電針組 0.1498±0.0162b

3 討論

P2X受體是ATP門控的離子通道，當它與胞外ATP結合時，P2X通道打開，允許Ca2+、單價陽離子以及小的有機離子通過［8］，繼而引起一系列生理或病理變化。P2X受體廣泛表達于從變形蟲到人類的一系列生物體中［9］。目前已克隆出7個P2X亞型，分別為 P2X1，P2X2，…P2X7［10］。這些亞單位能夠以同聚體或異聚體的形式形成功能性通道［11-12］。許多細胞同時表達不同類型的P2X亞單位，也暗示天然的P2X受體通常以異聚體的形式存在。本研究團隊對正常組3個亞型間的相關性進行分析發現，P2X3與P2X5呈顯著正相關(P＜0.05)，提示在大鼠胃組織中P2X3和P2X5二者之間可能在mRNA轉錄水平存在共表達，它們可能以同聚體的方式存在，也可能以異聚體的形式存在。

P2X1亞型在調節膀胱功能方面具有重要作用［4］。OREILLY 等［13］于2001 年用定量 RT-PCR 比較胎兒和成年人的膀胱表達7個已知P2X受體的情況，發現正常成人膀胱P2X1在信使RNA水平是主要嘌呤受體。之后，李永剛等［4］研究發現P2X1受體在膀胱出口部分梗阻大鼠膀胱組織中表達升高，推測其可能參與慢性膀胱出口梗阻后膀胱的生理或病理功能的調節。楊昕等［14］認為P2X1受體可能在介導嘌呤能神經對逼尿肌功能的調節中發揮重要作用。越來越多的研究證明P2X受體在胃腸道平滑肌的收縮和舒張中也發揮著重要作用［5］。本研究發現胃黏膜應激損傷模型組與正常組相比，大鼠胃組織P2X1mRNA表達顯著下降(P＜0.01)，提示P2X1亞型在胃功能的生理和病理調節中具有重要作用。胃和膀胱的共同特點之一是平滑肌都是其運動單元的一個重要組成部分，結合前人研究結果，筆者推測P2X1可能在平滑肌功能調節中具有重要的作用。

隨著人們對ATP及其受體P2X功能特點認識的不斷深入，有學者推測它們在針刺信號轉換機制中可能具有重要的作用［15］。針刺作為一種機械性刺激為主的復雜刺激源，只有轉化為生物信號才能被機體所識別。ATP所具備的信號分子特征，以及P2X受體的組織分布特點，強烈暗示ATP-P2X在針刺信號轉換中具有重要作用［15］。因此，本研究團隊以臨床上療效較為明確的“針刺足三里調節胃功能”為研究主題，以 P2X1、P2X3、P2X5作為觀察指標，在針刺信號轉換機制研究方面作一嘗試。本研究發現電針組大鼠胃組織P2X1mRNA顯著高于模型組(P＜0.05)，提示電針足三里穴對胃黏膜應激損傷的調節機制之一可能與P2X1mRNA表達上調相關。P2X受體是ATP門控的離子通道，其功能的發揮需要ATP的激活。有研究發現高濃度的ATP能在短時期內刺激P2X1受體高表達［16］。電針足三里刺激穴位可能通過經穴與臟腑的特異聯系以及神經-內分泌等途徑使支配胃平滑肌的副交感神經末梢釋放ATP增加以及胃組織表達P2X1等升高，在這些因素的協同作用下通過改善胃黏膜血流供應、胃組織能量供應等途徑促進胃潰瘍的愈合。此外，P2X1受體是血小板三種P2受體中的一種，其被ATP激活后可介導血小板聚集，有利于正常止血［17］，在潰瘍病灶的發生發展中，這將有利于防止潰瘍灶的進一步出血。當然，這只是根據研究結果所做的推測，具體機制還需進一步的實驗研究。今后也有必要對針刺局部組織和胃組織中的ATP和其他P2X受體亞型進行檢測，以更明確各個P2X受體亞型在針刺效應中的作用。

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