豬糞高效除臭微生物菌株篩選及發酵條件優化

張生偉，姚拓，黃旺洲，楊巧麗，滾雙寶＊

（1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州730070）

隨著人民生活水平的不斷提高，對肉類食品的需求不斷增加。據聯合國糧農組織（FAO）資料顯示［1］，到2050年全世界對肉類的需求量將增加73%，畜牧業將向集約化、規模化方向快速發展。隨之而來的是產生的大量畜禽糞便成為重要的環境污染源。有關數據統計［2］，2010年全國畜禽糞便產生量約為40億t，無害化處理僅占總排放量的不足10%。畜禽糞便產生的惡臭氣體在污染環境、影響畜禽正常生長發育和潛在生產性能發揮的同時也危害人類健康，因此加強惡臭氣體控制，減少對環境污染成為亟待解決的問題［3］。

目前畜禽糞便臭氣處理方法很多，包括物理方法、化學方法和生物方法［4］，而微生物除臭法是利用微生物的生理代謝作用降解惡臭物，具有脫臭率高、無二次污染等優點，已成為當前治理臭氣的一個重要途徑［5］。微生物除臭過程中主要是微生物的氧化硫化物、異養硝化和好氧反硝化及還原等功能方面起作用［6］，因此微生物除臭的關鍵在于篩選高效除臭微生物。長期以來人們不斷試圖改進優化篩選除臭微生物的新方法和途徑，因篩選方法的局限性和微生物的特異性等原因，篩選到的微生物除臭效果不理想。如Elmrini等［7］篩選的除臭菌只在發酵前期對氨氣去除率較高，對硫化氫去除作用不明顯。李彪和熊焰［8］篩選的除臭菌對氨氣和硫化氫的去除率達47.70%和62.50%。李珊珊等［9］篩選的除臭菌只有單一抑制氨氣釋放的作用，達不到高效除臭。Ransbeeck等［10］研究表明，臭氣成分復雜，每一種臭氣都需要特定的微生物來降解，單一菌株除臭效果低于多種微生物共同作用的效果。Meinen等［11］利用篩選的除臭菌株混合培養后得到的除臭劑對畜禽糞便有較強的除臭能力，除臭效果優于任一單個菌株，因而除臭菌群的篩選成為研究的熱點。當前日本和歐美國家在應用于微生物除臭制劑的微生物篩選及基礎研究、產品開發等方面處于領先地位，而我國的研究主要在國外商品化除臭制劑試驗方面［12］，對具有自主知識產權的除臭制劑的研究與開發很少。因此本研究首先篩選除臭菌株，再以微生物協同作用為出發點，通過菌株構建菌群的方法篩選高效除臭菌群。

控制和優化除臭發酵條件可更好的發揮除臭菌的除臭性能［13］。Yin等［14］通過感官法結合復篩法篩選出雞糞除臭微生物，通過優化發酵條件，更好的發揮了除臭菌的除臭性能。高紅梅等［15］對除臭微生物7NC的培養基和培養條件優化后得到了適合除臭微生物7NC生長的培養基和最佳培養條件。除臭發酵條件對提高除臭菌的除臭性能具有重要的意義，不同微生物有適合其發酵的最佳發酵條件，并且當前在反芻動物和禽類糞便發酵條件方面的研究較多，而在豬糞方面的研究鮮有報道，因此優化豬糞發酵條件具有重要的意義。

本研究應用選擇性培養基簡易、快速初選和復選相結合的方法，擬篩選出高效除臭微生物并對其除臭機理和發酵條件進行研究，旨在減輕畜禽糞便產生的惡臭氣體對環境的污染，為進一步研制和推廣應用微生物除臭劑提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮豬糞、堆肥豬糞源于蘭州市寶鑫養殖場；活性污泥、垃圾堆樣、秸稈腐敗樣源于武威市黃羊鎮牧草試驗站。試驗時間于2014年3月－10月，在草業生態系統教育部重點實驗室進行。

培養基：牛肉膏蛋白胨培養基、高氏改良一號培養基、馬丁氏培養基分別用于分離細菌、放線菌、真菌；馬鈴薯培養基用于真菌增殖培養；NH3選擇性培養基和H2S選擇性培養基用于除臭菌株的初選［16］。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 取新鮮豬糞、堆肥豬糞、活性污泥、秸稈腐敗樣、垃圾堆樣各10g置裝有90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中。用無菌水稀釋成不同濃度梯度（10－1～10－6），取100μL不同濃度稀釋液涂布于不同培養基平板上置于30℃恒溫培養箱培養5d［17］，參照Terence等［18］平板稀釋分離法進一步分離純化，純化后的單一菌株在顯微鏡下根據形態特征分類編號后于4℃斜面保存備用。

1.2.2 除臭菌初選 1）除NH3菌株初選：參照Liu等［19］篩選方法，取10mL NH3選擇性培養基分裝于搖菌瓶中，高壓滅菌后，注入10μL氨水（25%），將分離得到的菌株接種至相應的液體培養基，置于180r/min搖床上30℃恒溫培養3～7d，按5%（V/V）接種至搖菌瓶密封后置于30℃、180r/min搖床上恒溫培養5d后觀察菌液變化，若渾濁表明菌株具有降解NH3能力。

2）除H2S菌株初選：將分離得到的菌株接種至相應的液體培養基，置于180r/min搖床上30℃恒溫培養3～7d，按5%（V/V）接種至裝有200mL H2S選擇性培養基的燒杯中，在燒杯中放置一個50mL無菌小燒杯，內裝有12mL 25%（V/V）H2SO4，向小燒杯中加入4g硫化鐵（FeS）后密封，于30℃、180r/min搖床上恒溫培養5d后，觀察菌液渾濁變化，若渾濁表明菌株具有降解H2S能力［20］。

1.2.3 除臭菌復選 1）除NH3菌株復選：取200g新鮮豬糞加至2.5L的塑料桶中，將初選菌株在相應的液體培養基培養活化后，按豬糞質量的10%接種至豬糞，桶中放入50mL無菌小燒杯，內裝有20mL 2%硼酸溶液用于吸收NH3，用保鮮膜密封桶后蓋上桶蓋，置于30℃恒溫室中發酵培養。對照組加入等量滅活的菌液，每個處理3個重復。間隔5d參照Bernardo等［21］測定方法用硼酸吸收凱氏法測定NH3的釋放量，測定周期為30d。

2）除H2S菌株復選：取200g新鮮豬糞加至2.5L的塑料桶中，將初選菌株在相應的液體培養基培養活化后，按豬糞質量的10%接種至豬糞，桶中放入50mL無菌小燒杯，內裝有20mL鋅胺絡鹽吸收液用于吸收H2S，用保鮮膜密封桶后蓋上桶蓋，置于30℃恒溫室中發酵培養。對照組加入等量滅活的菌液，每個處理3個重復。間隔5d參照Yan等［22］測定方法用鋅胺絡鹽吸收比色法測定H2S的釋放量，測定周期為30d。

1.2.4 除臭組合菌群優化 取篩選出具有抑制氨氣和硫化氫釋放效果好的菌株分別于相應的培養基進行振蕩培養至對數生長后期，按照等比例混合制成組合菌群。參考L8（27）設計7因素2水平正交試驗，正交試驗的7個因素為篩選的不同菌株，水平為接菌和不接菌。正交試驗設計見表1，以等量滅活的菌液為對照，每個處理設3個重復。間隔5d測定NH3和H2S的釋放量，測定周期為30d。

1.2.5 除臭發酵條件優化 將培養活化后的除臭組合菌群按不同的接種量接種至新鮮豬糞，測定接種量對除臭發酵的影響。在最佳接種量的條件下，測定豬糞不同含水率對除臭發酵的影響［23］。在最佳接種量和含水率條件下測定麩皮添加量對除臭發酵的影響。對除臭發酵的影響以氨氣和硫化氫的釋放量為指標，測定方法同1.2.3。

1.3 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 2003軟件進行數據處理和繪圖，采用SPSS 19.0統計分析軟件對數據進行統計分析。

表1 除臭組合菌群優化正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal factor level of optimizing deodorant combination flora

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

將5種樣品在3種分離培養基上培養，分離出的純菌落根據形態特征分類編號，各樣品分離出的各類微生物結果見表2。由表2可知，不同樣品中分離出的菌株總數和種類不同。從菌株總數看，新鮮豬糞樣、堆肥豬糞樣和活性污泥樣中分離出的菌株數明顯多于垃圾堆樣和秸稈腐敗堆樣，新鮮豬糞中分離的菌株最多，垃圾堆中分離的最少。分離出的細菌和真菌數量基本相同，占分離菌株總數的36.15%和38.46%，放線菌占25.39%。

2.2 除臭菌株篩選

2.2.1 除臭菌的初篩 采用氨氣和硫化氫選擇性培養基對分離得到的130個菌株進行除臭性能的初步定性篩選（表3）。從表中可以看出，能利用NH3的除臭菌株共30株，其中細菌、放線菌、真菌的分離效率分別是19.15%，24.24%和26.00%。能利用H2S的除臭菌株共23株，其中細菌、放線菌、真菌的分離效率分別是21.28%，12.12%和18.00%。能利用NH3的除臭菌株分離效率是23.08%，高于能利用H2S的除臭菌株分離效率（17.69%）。

表2 不同樣品分離的菌株種類及數量Table 2 The species and number of strains isolated from different samples 株Strains

表3 不同來源樣品中可去除NH3和H2S的真菌、放線菌和細菌菌株數Table 3 Number of NH3and H2S removal fungi，actinomycetes and bacteria strains isolated from different sources samples

2.2.2 除臭菌復選 將初選定性試驗中篩選出的菌株以氨氣和硫化氫為指標進行復選試驗，各菌株在豬糞發酵過程中抑制氨氣和硫化氫釋放作用有差異，其中命名為DZ1、BX3、DZ3、BZ1、EZ3的5株菌株抑制氨氣釋放作用明顯，DZ1、DZ3、BZ1、EZ3是真菌，BX3是細菌。不同時間NH3的釋放量見圖1，BX3菌株在整個發酵過程中抑制作用明顯。總體來看，各菌株作用豬糞后在發酵前25d氨氣的釋放量呈依次下降趨勢，25d之后氨氣釋放趨于穩定；CX4菌株作用于豬糞后，發酵前10d氨氣的釋放量顯著高于其他菌株及對照組，表明CX4菌株對氨氣的釋放不但沒有抑制作用，反而促進釋放。

不同菌株在不同時間對氨氣的去除率見圖2，命名為DZ1、BZ1、EZ3的菌株主要在發酵前20d發揮作用，20 d后去除率不及其他菌株；DZ3菌株在發酵前期的去除率不及其他菌株，在發酵后期具有較穩定的抑制作用。BX3菌株在整個發酵過程中對氨氣的去除率都較高，尤其在20d之后去除率高于其他菌株。CX4菌株對氨氣的釋放具有促進作用，在發酵的15～20d對氨氣的去除率為正值，其他時間去除率為負值。與初選結果類同，抑制氨氣釋放效果好的5株菌中4株是真菌，只有BX3菌株是細菌，真菌數量占優勢。表明真菌較細菌和放線菌相比更有利于抑制氨氣的釋放。

在復選試驗中命名為AF2、BX3、AX4的菌株抑制硫化氫釋放作用明顯，其中BX3和AX4是細菌，AF2是放線菌。整個發酵周期中硫化氫的釋放量見圖3。AF2、BX3、AX4菌株作用豬糞后硫化氫的釋放量在發酵前15d呈快速下降趨勢，15d之后趨于穩定；CZ3菌株在發酵前15d硫化氫的釋放量呈下降趨勢，15～25d呈升高趨勢，25d之后呈下降趨勢，在15d之后的釋放量高于對照組和其他處理，促進了H2S的釋放。

不同菌株作用于豬糞在不同時間硫化氫的減少率見圖4，各菌株對H2S的去除率在發酵的前15d呈逐漸下降趨勢，在20d最低，20d之后又呈現上升趨勢。AX4菌株在整個發酵周期對H2S的去除率均為正值，0～5d和25～30d的除臭率高于75%；AF2菌株在發酵的20～25d硫化氫的去除率呈負值，其他時間去除率高于40%；BX3菌株除臭效果較穩定，在發酵前10d除臭率高于60%。

在抑制H2S釋放效果好的3株菌中，有2株細菌和1株放線菌，表明細菌在抑制H2S釋放過程中發揮主要作用。BX3菌株在整個發酵周期中對氨氣和硫化氫的釋放均有很顯著的抑制作用。

圖1 不同菌株作用下NH3的釋放量Fig.1 Result of the release amount of NH3 in different strains

圖2 不同菌株處理后豬糞樣品NH3的去除率Fig.2 NH3removal rate of the swine manure samples under the treatments of different strains

圖3 不同菌株作用下H2S的釋放量Fig.3 Result of the release amount of H2S in different strains

圖4 不同菌株處理后豬糞樣品H2S的去除率Fig.4 H2S removal rate of the pig feces samples under the treatments of different strains

2.3 除臭組合菌群優化

經F檢測各組合菌群在不同時間對NH3釋放量的影響均顯著或極顯著，進一步用SSR法檢測，結果見表4，不同組合菌群在不同時間對氨氣的釋放均有抑制作用，但抑制的程度不同。所有組合在發酵前20d氨氣的釋放量均極顯著低于對照，A組合在發酵5～25d氨氣的釋放量均顯著或極顯著低于其他組合，表明所有組合菌群對氨氣釋放均有抑制作用，而A組合抑制效果最好。

不同時間各組合對氨氣的釋放抑制作用不同，前20d各組合菌群對氨氣釋放抑制效果明顯，20d之后除A組合以外的其他組合氨氣釋放量均高于對照組，表明組合菌群有效抑制時間為發酵前20d，超過20d失去抑制作用。

經F檢測各組合菌群在不同時間里對H2S釋放量的影響顯著或極顯著，進一步用SSR法檢測，結果見表5，不同組合菌群在不同時間對硫化氫的釋放均有抑制作用但程度不同，所有組合菌群在發酵5～20d硫化氫的釋放量均極顯著的低于對照組，表明組合菌群對硫化氫的釋放均有明顯的抑制作用，A組合在發酵前25d硫化氫的釋放量顯著或極顯著低于其他組合，抑制作用最明顯。B組合在發酵前15d硫化氫的釋放量顯著或極顯著高于其他組合，可能因菌株間的拮抗作用導致抑制作用不明顯。

表4 不同菌種組合菌群對NH3釋放量的影響Table 4 The effect on NH3release amount of different strain combination flora mg/kg

表5 不同菌種組合菌群對H2S釋放量的影響Table 5 The effect on H2S release amount of different strain combination flora μg/kg

2.4 除臭發酵條件優化

2.4.1 不同接種量對NH3及H2S釋放的影響 將最佳組合菌群按不同接種量接種于新鮮豬糞，結果見圖5，接種量分別是10%和15%時，氨氣和硫化氫的釋放最低，為60.32mg/kg和21.13μg/kg，組合菌群抑制氨氣和硫化氫的釋放效果最好。

2.4.2 不同含水率對NH3及H2S釋放的影響 調節新鮮豬糞的含水率，按最佳接種量接種組合菌群，測定不同含水率對氨氣和硫化氫釋放的影響，由圖6可見，含水量分別是40%和30%時氨氣和硫化氫的釋放量最低，為59.87mg/kg和20.89μg/kg。

2.4.3 不同麩皮添加量對NH3及H2S釋放的影響 在最佳接種量和含水率條件下，按新鮮豬糞質量比添加麩皮，氨氣和硫化氫的釋放量如圖7所示，當麩皮添加量為10%，氨氣和硫化氫的釋放量最小為57.85mg/kg和19.64μg/kg，更好地發揮了組合菌群的除臭性能。

圖5 不同接種量對NH3和H2S釋放的影響Fig.5 The effect on NH3and H2S release amount in different inoculation

圖6 不同含水率對NH3及H2S釋放的影響Fig.6 The effect on NH3and H2S release amount in different water content

3 討論

圖7 不同麩皮添加量對NH3及H2S釋放的影響Fig.7 The effect on NH3and H2S release amount in different wheat bran addition

3.1 除臭菌株的篩選

本研究篩選出7株高效除臭菌，有4株分離自新鮮豬糞和堆肥豬糞，3株分離自活性污泥、垃圾堆樣、秸稈腐敗樣。原因可能是新鮮豬糞和堆肥豬糞中微生物所需的營養物質及磷、鉀、鋅、銅等元素含量豐富［24］，除臭菌富集，且除臭環境的營養狀況與菌源環境營養條件較為相近，更有利于除臭菌的篩選。而活性污泥、垃圾堆樣、秸稈腐敗樣等材料中含有大量的除臭菌，由于其菌源采集環境與除臭環境中營養條件差異太大，部分除臭菌在豬糞除臭環境中因適應性差而難以發揮除臭性能。7株菌中有4株真菌，2株細菌，1株放線菌，真菌的數量占優勢，這與Terence等［18］和Yan等［22］篩選的除臭菌株真菌數量占優勢的結果一致。篩選的BX3菌株除臭性能最優，對氨氣和硫化氫的去除率達80.07%和76.92%，可同時高效抑制氨氣和硫化氫的釋放。陳麗園等［25］在除臭菌株篩選方面做了相關研究，篩選的菌株使氨氣和硫化氫的釋放量降低67.95%和26.6%，抑制氨氣釋放效果較明顯，但對硫化氫作用不明顯，而本研究篩選的BX3菌株同時抑制氨氣和硫化氫的效果優于之前的研究報道。除臭過程中氨氣減少的趨勢與高穎等［26］篩選的菌株一致，而硫化氫的減少趨勢不一致，說明去除氨氣的機理一致，只是菌株之間除臭性能有差異［5］。硫化氫在發酵前15d呈快速減少趨勢，15～20d出現增長趨勢，20～30d又趨于平穩，15～20d出現增長的變化趨勢不同于其他研究，分析其原因可能是除臭菌大量繁衍，其數量達到最大，因菌間競爭營養物質而數量下降，從而硫化氫的釋放量出現增長趨勢，20d之后微生物的數量趨于穩定，硫化氫的釋放量也較為穩定。5株抑制氨氣釋放的菌在發酵的前25d作用明顯，氨氣的釋放量低于對照，超過25d后氨氣釋放量趨于平穩，與對照組無差異。原因可能是在發酵除臭的微環境中，25d之后氨氣濃度降低，菌間因營養物質減少競爭加劇，除臭菌的數量劇減導致氨氣釋放趨于平穩。分離的菌株CX4和CZ3，在發酵部分階段反而促進了氨氣和硫化氫的釋放導致釋放量高于對照，這可能是菌株生理代謝的差異使氨氣和硫化氫的釋放量增加。除臭菌降解臭氣的生理代謝過程及物質間的轉化機理還有待研究。影響篩選除臭菌結果的因素很多，但篩選方法是主要因素，至今沒有特定的培養基和篩選方法進行除臭微生物的直接篩選，很多研究都以感官定性法進行篩選，考慮到感官定性法存在一定的局限性，即在初選時有除臭能力，在復選時沒有除臭能力［27］。本試驗首先利用氨氣和硫化氫選擇性培養基進行簡易廣泛初選，再通過硼酸吸收法和鋅銨絡鹽吸收比色法復選，初選復選相結合的篩選方法避免了感官定性法篩選的局限性。篩選的除臭微生物可為畜禽糞便微生物除臭產品制備提供種質資源，其生理生化特性、菌株鑒定和除臭機理有待進一步研究。

3.2 除臭組合菌群的優化

自然界中，多種菌株構成的菌群可以抑制糞便堆肥等過程中復雜惡臭氣體的產生，這些菌株在一起才具備抑制復雜惡臭氣體的能力，當生存環境發生改變或缺少其中某一種或某幾種微生物后，整個微生物群的除臭能力會下降，甚至功能喪失［6，9］。本研究通過正交試驗將篩選的除臭菌株構建組合菌群，結果表明單個菌株的除臭效果均不及組合菌群，得到一組高效除臭菌群在豬糞發酵第5天氨氣和硫化氫的釋放減少率達到82.14%和80.84%，在發酵前25d都有顯著的抑制作用，組合菌群除臭效果優于菌株，這與趙晨曦等［28］在雞糞除臭菌群的研究結果一致，符合Yin等［14］提出的群體回歸自然的學術思想。優化得到的組合菌群的除臭效果明顯是由于畜禽糞便產生的臭氣污染是一個復雜的過程，成分復雜的惡臭氣體被去除需多種微生物互營共生作用、菌株間的加性效應等，形成的優勢混合菌群改變原菌群才能更好的抑制惡臭物質的產生［29］。優勢組合菌群有較好的除臭能力，菌群中各菌株發揮的作用也不盡一致，有的起除臭關鍵作用，有的為除臭菌的伴生菌，雖然不能起到除臭的作用，但能利用除臭過程中產生的中間產物作為營養物質，減小中間產物對后續反應的抑制，對臭氣分解起促進作用［13－14，30］。組合菌群的除臭效果明顯，其作用機理及其菌間關系還待進一步的研究。

3.3 除臭發酵條件優化

發酵條件是影響發酵水平的重要因素，在除臭發酵過程中發酵條件對微生物的生長和性能發揮具有重要的意義［4，13］。本研究測定豬糞含水率對發酵的影響，當含水率小于30%時，氨氣和硫化氫的釋放量隨著豬糞含水率的增加而下降，當含水率達到30%，硫化氫的釋放量最低，達到40%時氨氣的釋放量最低，之后隨著含水率的增加，氨氣和硫化氫的釋放量呈現增加趨勢，而氨氣的增加比硫化氫增加較為緩慢，這個變化趨勢與Frauke等［31］研究結果一致，但與Bernardo等［21］篩選的菌株變化趨勢不一致，原因可能是菌種間的差異性和豬糞成分的不同。豬糞含水率在30%和40%時硫化氫和氨氣的釋放量最低是由于氨氣易溶于水，增加適當的水分，可減少氨氣的釋放，并且為除臭菌的快速繁衍生長提供適合的微環境，隨著水分的增加改變了除臭菌的微環境，不能更好的發揮除臭菌的除臭性能［14，19］。

適宜的接種量可以縮短發酵階段菌體生長的延滯期，從而縮短發酵周期，最終提高除臭菌的除臭性能。而在短的發酵時間內獲得除臭所需的除臭菌數量，接種一定的除臭菌是必要的［12，23］。本研究在接種量為10%和15%時，除臭菌快速形成最佳優勢菌群，氨氣和硫化氫的釋放量最低，為除臭發酵的最佳接種量。低于最佳接種量時，除臭菌需要一個繁衍生長期，因此抑制效果不明顯。高于最佳接種量時菌體密度增大，不利于單個菌體的生長，導致菌體間發生競爭性抑制作用，同時高密度的除臭菌產生大量的初反應產物，后續反應不能及時進行而產生反應抑制，從而影響除臭效率［24，31］。在麩皮添加量為10%時，氨氣及硫化氫釋放量最低。麩皮添加量低于10%時，因除臭菌均是好氣性的，隨著麩皮添加量的增加，新鮮豬糞的透氣性增加，除臭菌的代謝活動和繁殖力加快，除臭功能增強。當麩皮的添加量高于10%時，氨氣和硫化氫的釋放量增加，其原因可能是過量的麩皮在微生物的作用下發酵分解形成一定的產物［5，7，9，15］對除臭反應有抑制作用。氨氣和硫化氫的減少機理及發酵后續產物還待進一步研究，優化得到的最佳除臭發酵條件可為除臭制劑的研發和生產提供依據和參考。

4 結論

1）本研究通過改進優化篩選方法后，篩選出可高效抑制豬糞中氨氣和硫化氫釋放的菌株5株和3株，其中命名為BX3的菌株，對氨氣和硫化氫的去除率達80.07%和76.92%。2）優化得到的高效除臭組合菌群對氨氣和硫化氫的去除率達82.14%和80.84%。3）研究優化發酵條件，在接種量分別為10%和15%，含水率40%和30%，麩皮添加量為10%時氨氣和硫化氫的釋放量最小，除臭微生物更好的發揮除臭性能。

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