二型花柱植物紅蓼的繁殖生物學研究

文慧慧，陳明林，張自生

（安徽師范大學生命科學學院，安徽省重要生物資源保護與利用研究重點實驗室，安徽 蕪湖241000）

異型花柱（heterostyly）是由基因調(diào)控的花的多態(tài)現(xiàn)象，包括二型花柱（distyly）和三型花柱（tristyly），柱頭與花藥的位置互補，高度不同，即交互式雌雄異位（reciprocal herkogamy）［1］。這種交互式雌雄異位的功能使得傳粉者的身體將花的花藥授粉與同一水平高度的柱頭上，這種功能和進化的意義有利于花粉準確傳遞，促進異交，避免雌雄器官的性別干擾以及減少自交傳粉對植物的不利影響［2］。二型花柱植物常常具有自交不親和系統(tǒng)，但在不同的植物中又表現(xiàn)出不同程度的可育性；三型花柱常常具有嚴格的自交不親和系統(tǒng)。異型花柱的研究是生態(tài)學最活躍的領(lǐng)域之一，異型花柱植物是進化生物學的理想材料。Ganders［3］于1979年對異型花柱做了較為詳盡的描述，除此之外大都是一些專屬專種的研究［4－5］。在我國異型花柱植物廣泛存在，該類型植物在特有科屬中相繼被報道［6］。蓼屬（Polygonum）有300多種植物，分布較為廣泛，其二型花柱現(xiàn)象最早在蕎麥屬（Fagopyrum）的蕎麥（Fagopyrum esculentum）中被發(fā)現(xiàn)［7］，蓼屬的愉悅蓼（Polygonum jucundum），蠶繭草（P.japonicum）的二型花柱現(xiàn)象已被詳細報道［8－10］。

紅蓼（Polygonum orientale）為一年生草本。莖直立，粗壯，高1～2m；葉寬卵形或卵狀披針形；托葉鞘筒狀，被長柔毛，沿頂端具綠色的翅；總狀花序頂生或腋生；瘦果近圓形，雙凹，黑褐色，有光澤，包于宿存花被內(nèi)。花期6－9月，果期8－10月。目前對紅蓼的研究是對其化學成分、質(zhì)量控制、藥理價值以及園林應(yīng)用等方面，尚沒有對紅蓼的二型花柱現(xiàn)象報道。本實驗主要通過對紅蓼的花部特征和繁育系統(tǒng)的初步探究，以確定其是否為二型花柱植物，是否存在雌雄異位現(xiàn)象，觀察其受精方式，并探討其是否具有異型自交不親和系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗時間為2013－2014年。實驗材料來源于蕪湖市天門山、蕪湖市鳩江區(qū)以及蕪湖市鏡湖區(qū)3個居群，于8－9月間采集的新鮮樣品，標本均存放于安徽師范大學標本館。

1.2 方法

1.2.1 花部生物學特征測量 在上述3個居群中各取30朵2種不同類型的紅蓼，用測微尺分別測得它們的雌、雄蕊高度，雌雄蕊高度差，花瓣長度。柱頭的寬度在顯微鏡（Olympus BH2）下測量，數(shù)據(jù)精確到0.01mm。

1.2.2 掃描電鏡與柱頭的石蠟切片觀察 取新鮮標本，將柱頭、花粉粒和用丙酮酸清洗過的飽滿種子，用導電膠帶粘于進樣臺上，在日立牌掃描電子顯微鏡（HitachiS4800）下觀察。

取盛開的2種不同類型的紅蓼各5朵，將長短柱頭分別固定于FAA中48h以上，采用石蠟切片技術(shù)［11］對柱頭進行觀察。

1.2.3 花粉管萌發(fā)觀察 取發(fā)育良好且柱頭未經(jīng)授粉的紅蓼長短柱花隔離昆蟲進行人工授粉，人工授粉時將整個柱頭涂抹一層花粉。設(shè)置以下幾個實驗組，型內(nèi)異交：紅蓼長柱花♀×紅蓼長柱花♂，紅蓼短柱花♀×紅蓼短柱花♂；型間異交：紅蓼長柱花♀×紅蓼短柱花♂，紅蓼短柱花♀×紅蓼長柱花♂；自交：紅蓼長柱花自花授粉，紅蓼短柱花自花授粉。每個組各取6朵花，將授粉后的花朵按0.5，1，2，3h不同時間段處理后置于FAA固定24h以上，用脫色苯胺藍熒光染色法制片［12］，在熒光顯微鏡（Olympus BH2）下，觀察拍照。

1.2.4 野外調(diào)查座果率與人工輔助授粉 在野外調(diào)查時，紅蓼居群大小用其開花數(shù)量衡量。在上述3個居群中每個居群隨機選取4個樣方，樣方大小為5m×5m，每個樣方隨機選取5個花序統(tǒng)計座果率，分別取平均值。樣方內(nèi)全為同型花則是單型居群，兩種花型都有則為雙型居群。

人工輔助授粉，設(shè)計處理：長柱花自花授粉，套袋；短柱花自花授粉，套袋；長柱花授同型花粉，套袋；短柱花授同型花粉，套袋；長柱花去雄授短柱花花粉，套袋；短柱花去雄，授長柱花花粉。選取5個花序，每個花序10～20個花。

1.2.5 訪花者的觀察 2014年8月20日和2014年9月6日分別對蕪湖市安徽師范大學花津校區(qū)和鏡湖區(qū)的紅蓼居群進行觀察，上午8時開始觀察到18時，每隔1h記錄一次訪花者。

1.3 統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0和Excel進行數(shù)據(jù)處理和顯著性檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 紅蓼的長、短柱型花Fig.1 The long and short morphs of P.orientale

圖2 紅蓼的石蠟切片圖Fig.2 The paraffin section of P.orientale

2.1 紅蓼二型花柱的特征

紅蓼的花部生物學特征顯示，紅蓼為兩型花，有長柱型花和短柱型花兩種類型，花瓣5片，為長橢圓形，花冠輻射對稱，雄蕊7枚，其中5枚與花瓣互生，著生于花瓣基部，子房基部生有腺體（圖1）。長柱型柱頭高度高于雄蕊（表1，t＝37.624，P＜0.001），短柱型柱頭高度低于雄蕊（表1，t＝57.210，P＜0.001）；長柱型柱頭寬度小于短柱型（表 1，t＝14.895，P＜0.001）；長柱型花粉數(shù)目多于短柱型（表1，t＝7.531，P＜0.05），但花粉大小小于短柱型（表1，t＝4.847，P＜0.001）；長柱型與短柱型柱頭乳突細胞的寬度差異不顯著（表1，圖2，t＝0.416，P＞0.05），長柱型具有長而稀的柱頭乳突細胞，短柱型柱頭乳突細胞短且排列緊密（表1，圖2A～D，圖3C，F(xiàn)；t＝13.038，P＜0.001）。長柱型和短柱型花粉粒均為球型，具有散孔，孔近似圓形，邊緣形狀不規(guī)則（圖3G～J）。

2.2 座果率與人工輔助授粉

從野外采集到的種子來看，紅蓼種子黑色，有光澤，扁平卵圓形，雙凹，頂端漸狹，在掃描電鏡下觀察到表面凹凸不平（圖3K～N）。

在野外條件下隨機統(tǒng)計其座果率，觀察到單雙居群間座果率有差異，雙居群座果率高于單居群，無論單居群還是雙居群，短柱型座果率均高于長柱型（表2）。

表1 紅蓼長、短柱花的花部特征 （平均值±標準差）Table 1 Measurement of the dimensions of flowers and pollen of long and short-morph flowers of P.orientale（mean±standard deviation）

自花授粉和型內(nèi)異花授粉都有少數(shù)種子，表明紅蓼自交和型內(nèi)異花授粉具有一定的親和性。型間異花授粉座果率略低于自然狀態(tài)下的座果率（表3）。

圖3 紅蓼的微形態(tài)特征（SEM）Fig.3 Micromorphological characteristics of P.orientale scanning electron microscopy

表2 紅蓼自然條件下雙居群、單居群的座果率 （平均值±標準差）Table 2 Fruit sets of P.orientalein different population in natural condition（mean±standard deviation）

2.3 訪花昆蟲行為

紅蓼的花期為6－9月，果期為8－10月，盛花期為8月，顏色鮮艷，通過野外觀察，并沒有發(fā)現(xiàn)鳥雀和蝙蝠的訪問，但發(fā)現(xiàn)至少12種訪花昆蟲，其訪花頻率見表4，部分訪花者見圖4，訪花者中薊馬、食蚜蠅以及螞蟻最為頻繁。

2.4 花粉管萌發(fā)的研究

自交和異交，授粉后，花粉在0.5h內(nèi)萌發(fā)，型內(nèi)異交、自交以及型間異交的花粉管萌發(fā)并無明顯差別，0.5h已能夠到達子房（圖5F，J，L，Q，R）。花粉管萌發(fā)時首先多數(shù)花粉管伸入中央花柱道（圖5A，D，G，K，O），只有少數(shù)花粉管沿著花柱壁，到達花柱基部（圖5C，I，M，O，P，R），沿子房壁到達胚珠基部的合點而達胚囊，受精方式為合點受精（圖5F，J，N，Q，R）。

表3 紅蓼人工輔助授粉的座果率Table 3 Fruit sets of P.orientalein different population under artificial pollination

圖4 紅蓼的花序和訪花者Fig.4 The florescence of P.orientale and visiting insects on the flowers

熒光實驗中觀察到花粉管在萌發(fā)過程中的行為：1）并不是所有花粉管都能萌發(fā)至子房，只有少數(shù)花粉管能夠到達子房。2）某些花粉管在伸長的過程中邊伸長邊交匯，最終交匯成一條或幾條花粉管沿子房壁到達胚珠基部合點。3）在熒光顯微鏡下觀察到花粉管為密集波浪線形。

3 討論

異型花柱是由基因控制的花部多態(tài)現(xiàn)象，有4種類型，包括二型花柱、三型花柱、柱頭高度兩型性（stigma-height dimorphism）和花柱對生（enantiostyly，有異常雄蕊存在），它們通過提高植物個體間花粉散布的精確性來增加雄性的交配效率［13－14］，其中二型花柱有兩種類型的花，即長柱花和短柱花，三型花柱則有3種類型的花，即長柱花，中柱花和短柱花［15］。已被發(fā)現(xiàn)蓼屬植物有300多種，其花部具有多態(tài)現(xiàn)象，已被報道的蓼屬植物，如金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）［16］，愉悅蓼［10］，蠶繭草［9］等都是典型的二型花柱，不同的蓼屬植物它們的花柱數(shù)目不同，在蠶繭草中不但有兩個柱頭的花，同時存在3個柱頭的花。紅蓼是典型的二型花柱植物，通過野外調(diào)查只發(fā)現(xiàn)了兩個柱頭的花，在多地的采樣中并未發(fā)現(xiàn)紅蓼的三柱頭的花。

大多數(shù)二型花柱植物的長柱型花要小于短柱型花，普遍認為不同花型的花部特征在一定程度上互補能夠起到調(diào)和雌雄功能的作用［14］，短花柱型的花柱頭位置比長花柱型的花低，比長柱花較難接受到花粉，因此通過增大花型來增加對傳粉昆蟲的吸引［15］，從而增加傳粉效率。已研究的蓼科植物中金蕎麥［16］的短柱花比長柱花大，對紅蓼兩種花型花直徑的測量符合上述觀點。紅蓼的柱頭、花藥高度、柱頭形態(tài)以及花粉粒大小均呈現(xiàn)二態(tài)性（表1）。長柱型柱頭寬度窄于短柱型，表皮細胞乳突較長且排列疏松，顯然能夠接受大的短柱型花粉。長柱型的花粉小而多也是對位置較低的短柱型柱頭較難接受到花粉的適應(yīng)。花柱的多態(tài)性能夠提高其繁殖適合度。短柱型柱頭表皮細胞乳突相對較多從而提高花粉黏附效率［17］，較大的花粉為萌發(fā)時通過長柱型花柱提供更多的能量［18－19］。這種典型的二型花柱特征能夠促進同配效率，符合資源分配原則。

在異型花柱的花中，同配（legitimate union）通常是可育的，異配（illegitimate union）往往可育性低或者是不可育的。植物的傳粉過程具有高度專一化的特點［20］，交互式雌雄異位是二型花柱的典型特征，傳粉者身體攜帶的花粉只能接觸同一高度的花器官，從而避免雌雄器官的性別干擾并有利于傳粉者實現(xiàn)精確傳粉并提高同配效率［2］，在自然條件下，我們發(fā)現(xiàn)雙居群座果率高于單居群，這說明了雜交對于花粉管萌發(fā)的優(yōu)勢，也說明了同型的花粉并不是完全可育的，異型花粉的結(jié)實率高于同型花粉，這與Darwin［21］的觀點一致。

圖5 紅蓼人工授粉處理后花粉管體內(nèi)生長圖Fig.5 Pollen tube growth in vivo of P.orientale following self-，intramorph and intermorph pollination

異型自交不親和系統(tǒng)（self-incrompatibility，SI）是異型花柱植物避免自交及型內(nèi)異交，同時促進型間異交的機制。傳粉后的自交不親和機制與配子體的選擇有關(guān)［13］。二型花柱常常伴有自交不親和系統(tǒng)，但是不同植物中又表現(xiàn)出不同程度的可育性。并不是所有的二型花柱在自交表現(xiàn)為完全自交不親和，不同植物自交親和性不同，艷麗耳草（Hedyotis pulcherrima）［22］、繡球茜（Dunnia sinensis）［19］自交表現(xiàn)出完全不親和性，唇形科（Labiatae）的Salvia brandegeei［22］、千蕨菜科（Lythraceae）的Decodon verticillatus［23］表現(xiàn)出自交親和，在已經(jīng)研究的蓼科植物中金蕎麥［16］自交不親和但型內(nèi)異交具有一定的親和性，本研究中的紅蓼自交和型內(nèi)異交均具有一定的親和性，但以異交為主。

通過熒光顯微鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)不同處理授粉后的花粉均可萌發(fā)，花粉管中胼胝質(zhì)分布較為均勻，0.5h內(nèi)自交、型內(nèi)異交以及型間異交均有花粉管萌發(fā)至子房，這與人工授粉的結(jié)果一致，自花授粉以及型內(nèi)異花授粉結(jié)實率低，表明紅蓼自交及型內(nèi)異交具有一定的親和性。花粉粒富含淀粉，淀粉是花粉管生長的主要能量［24］。在熒光下觀察到花粉管生長過程中具有匯合現(xiàn)象，有利于能量的聚集，使花粉管最大限度伸長，只有部分花粉管能夠沿子房壁到達胚珠，完成合點受精。

主要訪花者為薊馬、螞蟻和食蚜蠅。一般認為螞蟻在傳粉方面并不起作用，螞蟻口器用于吸收花蜜，螞蟻身體表面的抗菌物質(zhì)減弱花粉粒的附著［25］。薊馬與食蚜蠅是否為有效傳粉者需進一步研究。

綜上所述，紅蓼具有互補式雌雄異位，且花冠形態(tài)、柱頭大小、花粉數(shù)目及大小等方面均表現(xiàn)出二型性的特點，野外觀察到紅蓼常常以單居群存在，且雙居群座果率大于單居群，熒光實驗觀察到紅蓼的自交、型內(nèi)異交及型間異交花粉管萌發(fā)且0.5h內(nèi)均有少量花粉管萌發(fā)至子房，為合點受精方式。人工授粉時自交及型內(nèi)異交結(jié)實率低，是不是花粉管萌發(fā)至子房時子房對自交及型內(nèi)異交具有拒絕作用，這個問題也有待進一步研究。

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