植物細(xì)胞程序性死亡中的半胱氨酸蛋白酶研究進(jìn)展＊

王東方，曹 慧

（山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室 濰坊學(xué)院，山東 濰坊 261061）

程序性死亡或細(xì)胞凋亡（programed cell death，PCD）是多細(xì)胞生物體中一些細(xì)胞所采取的一種由自身基因調(diào)控的主動死亡方式［1］。近年來隨著動物和醫(yī)學(xué)中細(xì)胞凋亡的深入研究，植物的PCD 研究也成為植物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。許多研究表明，在眾多的環(huán)境脅迫例如干旱、高低溫和鹽堿脅迫下半胱氨酸蛋白酶mRNA 會積累［2-3］，在植物發(fā)生PCD 的某些發(fā)育階段過程中半胱氨酸蛋白酶mRNA 也會增加，這說明半胱氨酸蛋白酶（Caspase）與植物發(fā)生PCD 有關(guān)［4］。

1 Caspase的基本結(jié)構(gòu)和分類

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase），是一組與細(xì)胞因子成熟和細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白，是富含半胱氨酸的一類蛋白酶家族，它們的活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進(jìn)行切割，從而造成細(xì)胞凋亡。Caspase蛋白家族是細(xì)胞自殺機(jī)制的主要“執(zhí)行者”，Caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的啟動細(xì)胞死亡程序的執(zhí)行階段［5］。Caspase以前體形式合成，Caspase前體是由兩個亞單位組成的異二聚體，每個有活性的Caspase均來自于兩個前體的加工與結(jié)合，其后再形成異四聚體。Caspase活化經(jīng)兩次裂解，裂解位點(diǎn)均在天冬氨酸羥基端肽鍵，蛋白酶前體被切斷成三部份，H2N-端是抑制區(qū)域被移去，另一端COOH-端斷裂成一大一小亞單位稱為死亡區(qū)域，在每個二聚體內(nèi)大小亞單位相嵌形成一個以p片層組成的核心，兩側(cè)有α螺旋，兩大兩小亞單位再結(jié)合成活化酶，該四聚體在分子對應(yīng)的兩端有兩個活性位點(diǎn)，可作用于其自身和其他Caspase酶原，按順序依次激活Caspase，形成信號傳導(dǎo)機(jī)制的酶級聯(lián)反應(yīng)［6-7］。這種連鎖反應(yīng)的進(jìn)行有賴于Caspase的調(diào)節(jié)蛋白、輔助因子、反饋關(guān)系和閾限等控制。

Caspase有多種，多數(shù)和凋亡有關(guān)，少數(shù)和炎癥有關(guān)［8］。根據(jù)Caspase在級聯(lián)反應(yīng)上下游的位置及功能的不同可將Caspase家族大致分為兩種類型：I型Caspase，又稱為啟動型Caspase（Initiator Caspase），包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等，位于Caspase級聯(lián)反應(yīng)的最上游，能在其他蛋白輔助因子的參與下發(fā)生自我活化并激活下游的Caspase；Ⅱ型Caspase，又稱為執(zhí)行型Caspase（Executioner Caspase），包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等，其作用在于特異性地裂解底物使細(xì)胞發(fā)生生化及形態(tài)學(xué)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除此之外，還有一類Caspase包括Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-13、Caspase-14等，主要參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起輔助作用［9］。

2 Caspase參與了植物PCD 的過程

Caspase的研究源于線蟲（C.elegans）細(xì)胞程序化死亡的研究，是哺乳動物PCD 啟動和執(zhí)行階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，植物中雖然沒有分離出caspase基因，但是在植物細(xì)胞死亡過程中檢測到caspase活性的提高，已有證據(jù)表明植物細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生半胱氨酸蛋白酶的活化，推測其分子結(jié)構(gòu)與動物不同，在PCD中執(zhí)行的功能也可能不同［10］。用動物Caspase活性分析試劑盒檢測到湖北海棠根系存在Caspase-3或Caspase-7活性［11］；研究蘋果砧木新疆野蘋果和平邑甜茶細(xì)胞程序性死亡時，通過蛋白免疫印跡實(shí)驗發(fā)現(xiàn)干旱脅迫條件下兩種蘋果葉片都有類Caspase-3蛋白酶的發(fā)生，而根中沒有，通過Western bolt檢測出類Caspase-3的分子量大約是40KD，比動物的類Caspase-3的分子量（32KD）大8KD 左右［12］。

2.1 植物Caspase的種類

序列分析表明，在擬南芥基因組中，沒有編碼Caspase酶類的基因，但是在正在死亡的植物細(xì)胞中可以檢測到Caspase活性的升高，說明植物細(xì)胞程序性死亡過程依靠的是具有Caspase酶活性的其它種類的蛋白酶。基因組序列比對表明，植物中的某些序列編碼的蛋白酶與Caspase在空間結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，而且常用的Caspase酶類抑制劑可抑制其活性。在用menadione誘導(dǎo)煙草原生質(zhì)體細(xì)胞程序性死亡的研究中發(fā)現(xiàn)，Caspase的抑制劑Ac-DEVD-CHO 和Ac-YVAD-CHO 可以阻止DNA 的斷裂和PARP（poly-（ADP-ribose）polymerase）的降解［13］。目前，植物中已鑒定出來的半胱氨酸蛋白酶可以分為三類，其中豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶（1egumain）家族的液泡加工酶（vacuolar processing enzymes，VPEs）和metacaspase屬于半胱氨酸內(nèi)肽酶，它們在氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)上與Caspase具有相似性，是Caspase的同系物；絲氨酸內(nèi)肽酶（saspases）屬于枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，可以裂解人工合成的Caspase底物。最近的研究表明，VPEs、metacaspase和saspases在植物細(xì)胞程序性死亡過程中均起到類似Caspase酶類的關(guān)鍵性調(diào)控作用，參與調(diào)控植物PCD。

2.2 動植物Caspase的異同

與動物細(xì)胞凋亡重要組分Caspase相似，植物半胱氨酸蛋白酶也參與植物細(xì)胞死亡的調(diào)控。Poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）參與H2O2誘導(dǎo)的植物PCD，而植物PARP的降解依賴于細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，可被特異的Caspase-3抑制劑所抑制［14］。

動植物中的半胱氨酸蛋白酶的區(qū)別主要有以下兩點(diǎn)：（1）亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位不同，植物半胱氨酸蛋白酶定位于液泡和細(xì)胞壁，葉綠體中的半胱氨酸蛋白酶可以降解Rubisco，而動物Caspase蛋白酶活性僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，而不存在于液泡中；（2）同源性較低，研究表明，植物中的半胱氨酸蛋白酶從基因編碼到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能與動物Caspase蛋白家族相比均呈現(xiàn)出較低的同源性，所以對植物中是否真正存在與動物相似的由半胱氨酸蛋白家族介導(dǎo)的PCD 調(diào)控與執(zhí)行機(jī)制還存在爭議。

2.3 植物Caspase及其編碼基因

盡管對于半胱氨酸蛋白酶如何被生長發(fā)育或外部刺激信號激活，以及其如何參與調(diào)控細(xì)胞死亡的具體過程還不清楚，但關(guān)于半胱氨酸蛋白酶，已經(jīng)從許多植物中成功的分離出其編碼基因，根據(jù)植物半胱氨酸蛋白酶的基因表達(dá)特點(diǎn)可將其分為三類。

2.3.1 存在于植物正常發(fā)育過程中或在植物某些特殊時期表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶

Carne和Moore從中華獼猴桃（Actinidia chinensis）果實(shí)中分離到了一種半胱氨酸蛋白酶，并得到了其氨基酸序列，即actinidain［15］。Mbeguie等在研究杏樹果實(shí)成熟時發(fā)現(xiàn)一個編碼半胱氨酸蛋白酶基因高度表達(dá)，并成功提取其mRNA，為今后的研究提供了基礎(chǔ)［16］。Lee等分離到水稻半胱氨酸蛋白酶基因OsCP1，通過表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)OsCP1基因在水稻花藥絨氈層及未成熟的花藥中表達(dá)，T-DNA 插入突變體分析發(fā)現(xiàn)其主要參與水稻花粉發(fā)育過程［17］。嚴(yán)秀蕊等在水稻發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶相關(guān)基因OsCP2，其也在水稻花藥絨氈層及未成熟的花藥中表達(dá)，且只在花粉發(fā)育的空泡花粉時期到成熟時期進(jìn)行表達(dá)［18］。張紅巖等采用SSH（Suppression subtractive hybridization）和Race-PCR（Rapid-amplification of cDNA ends）技術(shù)克隆得到來自甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）矮化突變體‘NDF-1’的一個半胱氨酸蛋白酶相關(guān)基因Bncp5，相對定量RT-PCR 檢測表明此基因具有組織表達(dá)特異性［19］。Tripathi在玫瑰花瓣脫落過程中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活一個37KD 的伴隨乙烯反應(yīng)的半胱氨酸蛋白酶基因RbCP1，該基因與蛋白質(zhì)的降解過程聯(lián)系密切［20］。張國林等在花生果種皮中發(fā)現(xiàn)一個半胱氨酸蛋白酶基因AhPSG13，RT-PCR 檢測表明該基因在果種皮中特異表達(dá)［21］。

2.3.2 在生物脅迫和非生物脅迫條件下誘導(dǎo)表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶

在對擬南芥的逆境研究中發(fā)現(xiàn)了RD（responsive to dehydration）系列基因，包括rd19A 和rd21A 以及rd29A／cor78／lit78［22］。RD 系列基因已經(jīng)成為逆境研究中的重點(diǎn)，對于逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的交叉研究具有重要意義。臧慶偉以水分脅迫24h的cDNA 文庫中WSI-V-F10克隆的EST 為基礎(chǔ)，通過RACE方法獲得了小麥半胱氨酸蛋白酶基因TaCP（AY841792）［23］。朱家紅從橡膠樹膠乳中克隆了一個半胱氨酸蛋白酶基因HbCP1（DQ642886），半定量RT-PCR 結(jié)果顯示，乙烯和傷害誘導(dǎo)膠乳HbCP1基因的表達(dá)，推測膠乳中的HbCP1 蛋白可能具有防御功能［24］。曹慧等在蘋果屬植物八棱海棠中也克隆到了Caspase基因［25］。

2.3.3 在衰老的植物器官表達(dá)量增加或在衰老時期特異表達(dá)的半胱氨酸蛋白酶

由于衰老也是一種主動的、內(nèi)在因子調(diào)控的有序過程，并且與細(xì)胞死亡相關(guān)，有時將衰老視為程序化死亡過程［26］。在各種衰老的植物器官中分離到了許多編碼半胱氨酸蛋白酶的基因，它們被稱作衰老相關(guān)基因SAG（senescence associated genes），如擬南芥的SAG2和SAG12，玉米的See1和See2，油菜的LSC7和LSC790［27］，番茄的Cyp23［28］和煙草的NTCP223［29］，這些基因在衰老的葉片中均被上調(diào)。王勇等在研究大豆葉片衰老過程中發(fā)現(xiàn)了一個半胱氨酸蛋白酶相關(guān)基因，其在衰老的葉片中特異性表達(dá)［30］。沈法富等從遼棉9號衰老葉片中克隆了編碼半胱氨酸蛋白酶的cDNA，命名為Ghcysp（AY604196），基因表達(dá)分析表明，該基因在棉花的根、下胚軸、花、胚珠和幼葉中不表達(dá)，而在棉花的衰老葉片中特異性表達(dá)［31］。朱海生等在草莓中克隆島半胱氨酸蛋白酶基因FaCP，并發(fā)現(xiàn)隨著衰老程度的增加，F(xiàn)aCP 基因表達(dá)量逐漸增加，特別在衰老后期，顯著上升［32］。花椰菜花瓣衰老過程中半胱氨酸蛋白酶比對照也有顯著表達(dá)［33］。

3 結(jié)束語

半胱氨酸蛋白酶作為一類重要的蛋白酶家族，廣泛參與植物的各種生理過程。半胱氨酸蛋白酶參與貯藏蛋白的降解，在響應(yīng)逆境脅迫時負(fù)責(zé)蛋白的周轉(zhuǎn)；參與響應(yīng)病菌侵襲時的超敏反應(yīng)；參與木質(zhì)部分化和器官衰老引發(fā)的PCD。半胱氨酸蛋白酶基因不僅與植物的衰老相關(guān)，同時也參與信號傳導(dǎo)響應(yīng)外界環(huán)境中的生物和非生物脅迫［14，34］但在植物響應(yīng)非生物脅迫和生物脅迫以及器官分化和衰老的過程中，半胱氨酸蛋白酶的功能仍不夠明確，caspase酶類在植物中的真正功能還不清楚，有關(guān)植物細(xì)胞程序性死亡蛋白酶的研究尚處于起始階段，但隨著動物細(xì)胞凋亡研究的深入，將會進(jìn)一步揭示植物細(xì)胞程序性死亡中caspase酶類作用機(jī)理和機(jī)制。

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