鳥苷酸的發酵研究

韓永青 （常州市天成安全評價有限公司，江蘇 常州 213164）

1 烏苷酸簡介

5′-鳥嘌呤核苷酸，又名烏苷酸（Guanosine-5′-monophos?phate,代號GMP）。烏苷酸是組成核酸的五種核苷酸之一。核苷酸是生命組成形式的精華，在生物的遺傳變異、生長發育和蛋白質的合成中起著重要作用。核苷酸在醫療上也有很大的作用?？梢灾委熂毙院吐愿窝住⒅卸拘愿窝?、肝硬化、血小板減少癥、冠狀和動脈功能梗塞、風濕性心臟病等?？捎糜谥委煼派洳?，改善骨髓造血系統，使白血球回升，還能治療中心性視網膜炎、視神經萎縮癥等病。

經典的烏苷酸提取方法是隨著分子生物技術的發展而發展起來的。從質粒中提取鳥苷酸采用SDS堿裂解法：將細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對完全破壞，閉環的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要OH-處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細菌蛋白質破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被SDS包蓋，當用鉀離子取代納離子時，這些復合物會從溶液中有效地沉淀下來。離心除去變性劑后，就可從上清中回收復性的質粒DNA。從真核細胞中提取烏苷酸可采用蛋白酶K和苯酚處理細胞裂解液。用去垢劑如SDS溶解細胞膜并使蛋白質變性，再用蛋白酶K消化細胞或組織，烏苷酸通過有機溶劑苯酚抽提進行純化[1]。

2 烏苷酸生產工藝

烏苷酸有兩類生產方法。一類是酶法，它又可分為兩種:①用青霉菌5`-磷酸二酯酶水解酵母核糖核酸(RNA)，②在一定條件下由細菌內部的酶降解RNA，并使細菌自溶，從而得到核苷酸。另一類是發酵法，它也可分兩種方法:①先發酵生產核苷,然后再磷酸化制取烏苷酸。

②利用細菌發酵一步生產核苷酸。在兩類方法中,目前以發酵法為主。

2.1 生產原理[2]

酶解法生產5’-核苷酸起始于日本，50-60年代研制成功。其技術關鍵是篩選到產生5’-磷酸二酯酶的菌株。5’-磷酸二酯酶可催化RNA成寡核苷酸分子的核糖上碳原子羥基與磷酸之間形成的二酯鍵斷裂，隨之生成4種5’-單核苷酸。1957年，日本科學家從桔青酶中分離出5’-磷酸二酯酶，從而發展形成酶解法生產5’-鳥苷酸。

2.2 磷酸二酯酶的制備[3]

將核酸降解為5’-單核苷酸，關鍵的一步是找到大量產生5’-磷酸二酯酶的菌株。5’-磷酸二酯酶可由桔青酶或金色鏈霉菌產生。

桔青酶在察氏斜面培養基培養3-4天，即可制作麩皮去，30℃培養5天左右曲子成熟。制作的曲子用水浸泡，保溫適當時間后進行抽提，提取液即為初酶液。

5’-磷酸二酯酶也可采用液體深層發酵法獲得，使用菌種也為桔青酶，其工藝流程：斜面菌種培養-種子培養-發酵培養-濾液。

此種發酵液的酶活可達600U/ML。利用金色鏈霉菌生產5’-磷酸二酯酶一般采用液體深層發酵法。金色鏈霉菌不僅含有5’-磷酸二酯酶，同時還含有脫氨酶，脫氨酶可使4種單核苷酸中的5’-腺苷酸、經脫氨后生成5’-肌苷酸，因此，在使用該菌生產助鮮劑時，由于含有兩種酶，則可以同時得到肌苷酸和鳥苷酸。

2.3 烏苷酸提取

鮮酵母制備：以糖蜜或亞硫酸紙漿廢液培養面包酵母，經離心后得濕菌體即為鮮酵母。

抽提：目前采用的可分為濃鹽法和堿解法兩種方法進行提取。

①濃鹽法：將鮮酵母加適量水后，加NaCL至其濃度為10%左右，保溫，攪拌，離心取上清液。調pH后離心收集沉淀物，洗滌除雜即可得到烏苷酸泥。

②堿解法：將新鮮酵母壓榨成酵母泥，加NaOH水溶液，在一定溫度下低速攪拌。離心去掉菌體碎渣。上清液調，離子交換樹脂對不同的5’-單核苷酸pH，攪拌時加MgCl2，離心后取沉淀物溶于水中。

2.4 烏苷酸酶解

將一定濃度的烏苷酸溶液加溫，并加入5’-磷酸二酯酶。經酶解一定時間后升溫。離心后可得5’-單核苷酸的混合液。

2.5 5’-鳥苷酸的分離

鳥苷酸的分離一般采用離子交換樹脂法。該方法的原理是在一定條件下，離子交換樹脂對不同的5’-單核苷酸有不同的吸附力。隨著pH值的變化，不同單核苷酸上的氨基解離的程度不同，這樣可按不同順序依次洗脫下來。其具體作法：樹脂處理-陽離子樹脂柱分離-去除5’GMP-去陰離子樹脂柱-洗脫5’GMP.

3 結語

目前，國內外大力開展固定化5’-磷酸二酯酶和脫氨酶的固定化技術。國外由于采用固定化酶技術，使成本降低，烏苷酸降解率穩定，有利于單核苷酸的分離和精制。缺點和酶活力回收率不高，載體成本高，應用5’-磷酸二酯酶降解酵母烏苷酸，核苷酸轉化率可達70%以上。

[1]馮琦.核酸藥物的研究現狀與展望[J].中國生化藥物雜志，2006(3):156-159.

[2]蔡顯鵬等.烏苷發酵過程分析[J].食品與發酵工業，2002,28（9）：5-9.

[3]楊靜，吳大成，金輝等.反義核酸藥物的研究和應用[J].醫學學報2008(7).