鳥苷酸的發(fā)酵研究

韓永青 （常州市天成安全評價有限公司，江蘇 常州 213164）

1 烏苷酸簡介

5′-鳥嘌呤核苷酸，又名烏苷酸（Guanosine-5′-monophos?phate,代號GMP）。烏苷酸是組成核酸的五種核苷酸之一。核苷酸是生命組成形式的精華，在生物的遺傳變異、生長發(fā)育和蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用。核苷酸在醫(yī)療上也有很大的作用?？梢灾委熂毙院吐愿窝?、中毒性肝炎、肝硬化、血小板減少癥、冠狀和動脈功能梗塞、風(fēng)濕性心臟病等。可用于治療放射病，改善骨髓造血系統(tǒng)，使白血球回升，還能治療中心性視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮癥等病。

經(jīng)典的烏苷酸提取方法是隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展起來的。從質(zhì)粒中提取鳥苷酸采用SDS堿裂解法：將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中，會使細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對完全破壞，閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因?yàn)樗鼈冊谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只要OH-處理的強(qiáng)度和時間不要太過，當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被SDS包蓋，當(dāng)用鉀離子取代納離子時，這些復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來。離心除去變性劑后，就可從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。從真核細(xì)胞中提取烏苷酸可采用蛋白酶K和苯酚處理細(xì)胞裂解液。用去垢劑如SDS溶解細(xì)胞膜并使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K消化細(xì)胞或組織，烏苷酸通過有機(jī)溶劑苯酚抽提進(jìn)行純化[1]。

2 烏苷酸生產(chǎn)工藝

烏苷酸有兩類生產(chǎn)方法。一類是酶法，它又可分為兩種:①用青霉菌5`-磷酸二酯酶水解酵母核糖核酸(RNA)，②在一定條件下由細(xì)菌內(nèi)部的酶降解RNA，并使細(xì)菌自溶，從而得到核苷酸。另一類是發(fā)酵法，它也可分兩種方法:①先發(fā)酵生產(chǎn)核苷,然后再磷酸化制取烏苷酸。

②利用細(xì)菌發(fā)酵一步生產(chǎn)核苷酸。在兩類方法中,目前以發(fā)酵法為主。

2.1 生產(chǎn)原理[2]

酶解法生產(chǎn)5’-核苷酸起始于日本，50-60年代研制成功。其技術(shù)關(guān)鍵是篩選到產(chǎn)生5’-磷酸二酯酶的菌株。5’-磷酸二酯酶可催化RNA成寡核苷酸分子的核糖上碳原子羥基與磷酸之間形成的二酯鍵斷裂，隨之生成4種5’-單核苷酸。1957年，日本科學(xué)家從桔青酶中分離出5’-磷酸二酯酶，從而發(fā)展形成酶解法生產(chǎn)5’-鳥苷酸。

2.2 磷酸二酯酶的制備[3]

將核酸降解為5’-單核苷酸，關(guān)鍵的一步是找到大量產(chǎn)生5’-磷酸二酯酶的菌株。5’-磷酸二酯酶可由桔青酶或金色鏈霉菌產(chǎn)生。

桔青酶在察氏斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)3-4天，即可制作麩皮去，30℃培養(yǎng)5天左右曲子成熟。制作的曲子用水浸泡，保溫適當(dāng)時間后進(jìn)行抽提，提取液即為初酶液。

5’-磷酸二酯酶也可采用液體深層發(fā)酵法獲得，使用菌種也為桔青酶，其工藝流程：斜面菌種培養(yǎng)-種子培養(yǎng)-發(fā)酵培養(yǎng)-濾液。

此種發(fā)酵液的酶活可達(dá)600U/ML。利用金色鏈霉菌生產(chǎn)5’-磷酸二酯酶一般采用液體深層發(fā)酵法。金色鏈霉菌不僅含有5’-磷酸二酯酶，同時還含有脫氨酶，脫氨酶可使4種單核苷酸中的5’-腺苷酸、經(jīng)脫氨后生成5’-肌苷酸，因此，在使用該菌生產(chǎn)助鮮劑時，由于含有兩種酶，則可以同時得到肌苷酸和鳥苷酸。

2.3 烏苷酸提取

鮮酵母制備：以糖蜜或亞硫酸紙漿廢液培養(yǎng)面包酵母，經(jīng)離心后得濕菌體即為鮮酵母。

抽提：目前采用的可分為濃鹽法和堿解法兩種方法進(jìn)行提取。

①濃鹽法：將鮮酵母加適量水后，加NaCL至其濃度為10%左右，保溫，攪拌，離心取上清液。調(diào)pH后離心收集沉淀物，洗滌除雜即可得到烏苷酸泥。

②堿解法：將新鮮酵母壓榨成酵母泥，加NaOH水溶液，在一定溫度下低速攪拌。離心去掉菌體碎渣。上清液調(diào)，離子交換樹脂對不同的5’-單核苷酸pH，攪拌時加MgCl2，離心后取沉淀物溶于水中。

2.4 烏苷酸酶解

將一定濃度的烏苷酸溶液加溫，并加入5’-磷酸二酯酶。經(jīng)酶解一定時間后升溫。離心后可得5’-單核苷酸的混合液。

2.5 5’-鳥苷酸的分離

鳥苷酸的分離一般采用離子交換樹脂法。該方法的原理是在一定條件下，離子交換樹脂對不同的5’-單核苷酸有不同的吸附力。隨著pH值的變化，不同單核苷酸上的氨基解離的程度不同，這樣可按不同順序依次洗脫下來。其具體作法：樹脂處理-陽離子樹脂柱分離-去除5’GMP-去陰離子樹脂柱-洗脫5’GMP.

3 結(jié)語

目前，國內(nèi)外大力開展固定化5’-磷酸二酯酶和脫氨酶的固定化技術(shù)。國外由于采用固定化酶技術(shù)，使成本降低，烏苷酸降解率穩(wěn)定，有利于單核苷酸的分離和精制。缺點(diǎn)和酶活力回收率不高，載體成本高，應(yīng)用5’-磷酸二酯酶降解酵母烏苷酸，核苷酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%以上。

[1]馮琦.核酸藥物的研究現(xiàn)狀與展望[J].中國生化藥物雜志，2006(3):156-159.

[2]蔡顯鵬等.烏苷發(fā)酵過程分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2002,28（9）：5-9.

[3]楊靜，吳大成，金輝等.反義核酸藥物的研究和應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)學(xué)報2008(7).