甜高粱釀酒酵母耐受性分析

薛 梅，張曉雙，段開紅，田瑞華

(內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古呼和浩特 010018)

?

甜高粱釀酒酵母耐受性分析

薛 梅，張曉雙，段開紅，田瑞華

(內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古呼和浩特 010018)

[目的] 分析4株甜高粱釀酒酵母菌的耐受性。[方法]研究了4株發酵工程實驗室保存的甜高粱酵母菌和1株商業酵母菌對乙醇、蔗糖、酸、堿、滲透壓的耐受性，通過觀察在這4種因素下菌落的生長情況，對其耐受性進行分析。[結果]試驗表明，4株甜高粱酵母菌均表現出不同的耐受性，在不同的脅迫環境下均表現出較強的抗脅迫能力。[結論]研究可為利用甜高粱秸稈進行乙醇發酵的菌種選擇提供參考依據。

甜高粱；釀酒酵母；耐受性

在傳統不可再生能源日益匱乏的今天，具有可再生能力的清潔能源起到越來越重要的作用。作為可再生清潔能源的一種，生物質能源也以驚人的速度發展。甜高粱是主要的生物質能源，而且甜高粱秸稈中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量很高，經粉碎后可直接發酵生產乙醇[1]。甜高粱的適應性較強，可以在全國大部分地區種植，甜高粱有抗旱、耐澇、耐鹽堿、耐瘠薄、耐高溫和寒冷等特性[2]。同時甜高粱是所有生物質能源品種中，投入最低、風險最小、產業鏈最長、適應區域最廣、產出最高的生物能源乙醇的作物品種[3]。甜高粱秸稈營養價值高，可作飼料、釀酒、生產乙醇等，其作為新能源作物，具有極大的開發價值。

筆者研究了4株發酵工程實驗室保存的甜高粱酵母菌和1株商業酵母菌對乙醇、高糖、酸堿、滲透壓的耐受性，以期為內蒙古特殊地區甜高粱秸稈生產乙醇提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。內蒙古農業大學發酵工程實驗室經過10年的甜高粱汁特定培養基馴化培養的菌種71b、90#、Hc、X7、Hb、AQ、Ba、Bc、120S、MO，作為供試菌種。市場銷售的商業酵母菌為安琪的高活性釀酒干酵母。

1.1.2 主要試劑。葡萄糖、細菌學蛋白胨、酵母提取物為生化級試劑，無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、蔗糖、氯化鈉為分析純試劑。

1.1.3 主要儀器。手持糖度計、恒溫培養箱、超凈臺、pH計、顯微鏡、血球計數板。

1.1.4 甜高粱汁培養基。甜高粱汁，錘度為2左右，用蒸餾水和蔗糖調節。

1.2 方法1.2.1

酵母菌數的測定。每個試管移入5 ml甜高粱汁培養基，置于28 ℃的條件下培養。分別在12 h后、24 h后以血球計數法測定總菌數和出芽率。通過美蘭染色測定死亡率[4-5]。

1.2.2 乙醇耐受性的測定。每個試管移入10 ml甜高粱汁液體培養基，培養基中乙醇的濃度分別為10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%[6-7]。接種量為10%，28 ℃培養40 h后，移取菌液點種于固體培養基上，在28 ℃的培養箱中培養24～48 h，觀察并記錄。

1.2.3 耐糖度的測定。每個試管移入10 ml甜高粱汁液體培養基，培養基中蔗糖的濃度分別為300、400、500、600、650、700、750、800 g/L[8]。接種量為10%，28 ℃培養40 h后，移取菌液點種于固體培養基上，28 ℃的培養箱中培養24～48 h，觀察并記錄。

1.2.4 耐酸堿的測定。每個試管分別移入10 ml 用鹽酸和氫氧化鈉調整pH至1.0、1.5、2.0、3.0、10.0、11.0、12.0、12.5、13.0[9-10]培養基。將菌種接入培養基中，接種量為10%，28 ℃培養40 h，移取菌液點種于固體培養基上，28 ℃培養，24～48 h后觀察并記錄。

1.2.5 耐滲透壓的測定。配制固體甜高粱汁培養基，培養基中NaCl的濃度分別為180、200、220、240、260、280、300、320、340、360 g/L[11-12]。將已活化好的菌液點種于培養基上，在28 ℃的培養箱中培養72 h，觀察并記錄。

2 結果與分析

2.1 總菌數和出芽率的測定結果

分別對培養12及24 h后總菌數、出芽率的測定結果進行分析。由圖1～4可知，以菌種AQ為參照，出芽率在15%～30%[4]，死亡率<0.5%，在短時間內能達到7.0×107CFU/ml的菌株。試驗表明，以上試驗的死亡率均小于0.5%。最終菌種90#、Hb、71b、120S相對較符合要求。對這4株菌和AQ的耐受性進一步分析。

2.2 耐乙醇的測定結果

乙醇對細胞的抑制作用很復雜，主要表現在抑制酵母的增殖速度、存活性和發酵力3個方面[13]。酵母菌的生長會隨著乙醇濃度的增加而減弱。表1可得，在乙醇含量為24%時各菌種仍然能夠生長，所以這5株菌都表現出了良好的乙醇耐受性。在乙醇含量為16%～18%時，對這5株菌的生長開始產生毒害作用。

表1 耐乙醇試驗結果

注：“+++”表示生長良好，“++”表示生長一般，“+”表示生長菌落少，“-”表示不生長。

2.3 耐酸堿的測定結果

從表2中可知，5株菌對酸堿均表現出不同的耐受性，菌株90#、71b在pH是1.0的強酸性環境中仍能生長，其他菌在pH為3.0左右時大多數出現抑制。Hb對堿性環境的耐受性是11.0，其他均是12.0。但是在pH是10.0時，菌株90#、Hb的菌株已出現生長抑制現象。這5株菌都表現出較強的耐酸、耐堿能力。

表2 耐酸堿的試驗結果

注：“+++”表示生長良好，“++”表示生長一般，“+”表示生長菌落少，“-”表示不生長。

2.4 耐糖度的測定結果

蔗糖不僅是甜高粱發酵生產乙醇的主要基質，也是酵母賴以生活的能源物質。但是高濃度的糖對酵母生長有抑制作用，而且，高滲透壓會導致酵母細胞水分流失，水活性降低[8]。從表3中可以看出，5株酵母菌均表現出良好的耐高糖特性，5株菌在糖濃度為750 g/L的高糖濃度下均能生長，所以5株菌的耐糖度都達到750 g/L。在糖濃度為700 g/L時，對90#菌株的生長有了抑制作用。在糖濃度為800 g/L時，完全抑制了這5株菌的生長。

2.5 耐滲透壓的測定結果

從表4中可以看出，這5株酵母菌對于滲透壓均表現出較高的耐受性，在NaCl濃度為360 g/L時依然生長。原因可能是20 ℃時，鹽飽和度為36%，而凝固后溫度降低，培養基中出現細小晶體，所以固體培養基中NaCl濃度達不到36%，而且在固體培養基上的菌落很細小，所以這5株菌在高鹽脅迫下仍然能生長。

表3 耐糖度的試驗結果

注：“+++”表示生長良好，“++”表示生長一般，“+”表示生長菌落少，“-”表示不生長。

表4 耐滲透壓試驗結果

注：“+++”表示生長良好，“++”表示生長一般，“+”表示生長菌落少，“-”表示不生長。

3 結論

試驗研究了以甜高粱莖汁為原料發酵制取乙醇的5株釀酒酵母菌，測量酵母菌細胞數、出芽率和酵母菌的耐受性。通過酵母的細胞數和出芽率得出，AQ、Hb、120S和71b符合生產應用，而90#發酵后會產生特殊香味，有待進一步的研究。

經過以上5株釀酒酵母的耐受性試驗，結果表明：這5株酵母菌受到乙醇的毒害耐受上限為24%。AQ、90#、71b、120S菌株的耐酸能力達到pH 1.5，Hb的耐酸特性為2.0；AQ、90#、71b、120S菌株的耐堿達到12.0，Hb菌株的耐堿達到11.0。5株菌的耐糖度都達到750 g/L。5株菌在NaCl濃度為360 g/L時依然生長。

這5株菌對乙醇、糖、鹽、酸和堿的耐受性較高，為內蒙古部分特殊鹽堿地區利用甜高粱秸稈發酵生產乙醇提供了參考。此研究對于在特殊環境條件下工業生產中酵母菌的選擇具有重要意義。

[1] 代樹華.甜高粱莖稈固態發酵酒精及飼料的研究[D].北京：北京化工大學，2009.

[2] 董婷婷,張新，南翔，等.內蒙古林西地區甜高粱高產優化栽培技術[J].中國農學通報,2010(5):87-92.

[3] 趙立欣,張艷麗,沈豐菊.能源作物甜高粱及其可供應性研究[J].可再生能源,2005(4):37-40.

[4] 李維青.釀酒酵母菌及其出芽[J].釀酒科技,1981(2):2-7.

[5] 陸琦,張穗生，吳仁智，等.三株甘蔗糖蜜酒精發酵高產酵母菌株的篩選[J].廣西科學,2010(4):368-372，376.

[6] 魏立杰,田瑞華,段開紅，等.11株野生沙棘酵母菌株的耐受性分析[J].釀酒,2013(3):36-38.

[7] 葉美莉.乙醇酵母脅迫耐性及其基因表達響應分析[D].廣州：華南理工大學，2011.

[8] 薛軍俠.釀酒酵母的篩選鑒定及耐受性初步研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2007.

[9] 魏立杰.11株野生沙棘酵母的發酵特性及生產適用性研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2013.

[10] 劉興艷.低pH對釀酒酵母酒精發酵的影響及酵母應答酸脅迫機制初探[D].北京：中國農業大學，2015.

[11] 賀東海.耐高滲酒精酵母的篩選[D].濟南：山東輕工業學院，2011.

[12] 林秋葉,趙長新,金鳳燮.兩株耐高滲釀酒酵母的生理特性比較[J].釀酒,2003(2):27-29.

[13] 李雪雁，趙華.酒精發酵副產物對酵母菌生長的影響[J].釀酒,2001(6):58-60.

Analysis of Tolerance of Yeast from Sweet Sorghum Stalk

XUE Mei, ZHANG Xiao-shuang, DUAN Kai-hong et al

(College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010018)

[Objective] To analyze tolerance of four yeasts from sweet sorghum stalk. [Method] Tolerance of four yeasts from sweet sorghum stalk and one commercial yeast to alcohol, sugar, acid and alkali, and osmotic pressure was researched in this study. Tolerance assay was observed by the colony growth under five treatments. [Result] Results showed that these four yeasts all exhibited high survival rate and different resistance level to various stresses. [Conclusion] This study provides a valuable reference for future studies on the stains selection for the fermentation of sweet sorghum stalk.

Sweet sorghum; Yeast; Tolerance

薛梅(1990-)，女，內蒙古烏蘭察布人，碩士研究生，研究方向：發酵工程技術應用。

2015-11-11

S 188+.4

A

0517-6611(2015)35-145-03