藏雪蓮多糖通過P38絲裂原激活蛋白激酶通路減輕中波紫外線輻射后皮膚角質形成細胞凋亡引起炎性損傷的研究

郭 硯，孫 娟，王麗雯

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·論著·

藏雪蓮多糖通過P38絲裂原激活蛋白激酶通路減輕中波紫外線輻射后皮膚角質形成細胞凋亡引起炎性損傷的研究

郭 硯，孫 娟，王麗雯

目的 探討藏雪蓮(SSB)多糖是否通過P38絲裂原激活蛋白激酶(P38MAPK)通路減輕中波紫外線(UVB)輻射后皮膚角質形成細胞(HaCaT細胞)凋亡引起炎性損傷。方法 2014年10月—2015年3月，提取SSB多糖，體外培養HaCaT細胞，將HaCaT細胞分為低劑量輻射組(30 mJ/cm2，輻射1 h，A組)和高劑量輻射組(60 mJ/cm2，輻射1 h，B組)；將A組和B組又分別分為對照組(1組)、輻射組(UVB，2組)、低劑量SSB多糖組(UVB+SSB 10 mg/ml，3組)和高劑量SSB多糖組(UVB+SSB 40 mg/ml，4組)。采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測并比較白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、P38MAPK、P53、B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關X(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)水平。結果 A2組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于A1組，Bcl-2水平低于A1組(P<0.05)；A3組IL-6、TNF-α、P38MAPK、Caspase-3水平高于A1組(P<0.05)；A4組TNF-α、Bcl-2水平高于A1組(P<0.05)；A3組、A4組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于A2組，Bcl-2水平高于A2組(P<0.05)；A4組IL-6、TNF-α、Caspase-3水平低于A3組，Bcl-2水平高于A3組(P<0.05)。B2組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于B1組，Bcl-2水平低于B1組(P<0.05)；B3組IL-6、TNF-α水平高于B1組，Bcl-2水平低于B1組(P<0.05)；B4組IL-6、Bcl-2水平高于B1組，TNF-α、Caspase-3水平低于B1組(P<0.05)；B3組、B4組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于B2組，Bcl-2水平高于B2組(P<0.05)；B4組IL-6、TNF-α、Caspase-3水平低于B3組，Bcl-2水平高于B3組(P<0.05)。結論 SSB多糖通過P38MAPK通路減少UVB輻射后HaCaT細胞凋亡，進而減輕HaCaT細胞的炎性損傷。

紫外線；藏雪蓮多糖；皮膚角質形成細胞；白細胞介素6；腫瘤壞死因子α；絲裂原激活蛋白激酶類；淋巴瘤, B細胞；Bcl-2相關X蛋白質；半胱氨酸蛋白酶類

郭硯，孫娟，王麗雯.藏雪蓮多糖通過P38絲裂原激活蛋白激酶通路減輕中波紫外線輻射后皮膚角質形成細胞凋亡引起炎性損傷的研究[J].中國全科醫學，2015，18(27)：3314-3319.[www.chinagp.net]

Guo Y, Sun J, Wang LW.Alleviation of inflammatory damage induced by the apoptosis of HaCaT cells after ultraviolet B radiation bySaussureaTridactylaSch.-Bip. polysaccharides through P38MAPK passage[J].Chinese General Practice，2015，18(27)：3314-3319.

[10]知，經臺盼藍染色后，SSB多糖劑量低于10 mg/ml時，經高劑量UVB輻射(60 mJ/cm2，輻射1 h)后，SSB多糖對HaCaT細胞的腫脹、漂浮、藍染數量異常以及形態異常沒有緩解作用，且SSB多糖劑量高于40 mg/ml時，HaCaT細胞的死亡率大于SSB多糖40 mg/ml時，且SSB多糖低劑量(UVB+SSB 10 mg/ml)與SSB多糖高劑量(UVB+SSB 40 mg/ml)能夠減輕UVB輻射后HaCaT細胞的氧化損傷。但其通過減輕炎癥進而減輕氧化損傷的文獻尚未見報道。故本

本研究創新點：

藏雪蓮是最負盛名的高山植物之一，是高原地區傳統的珍貴藏藥，并被藏族人民視為“圣藥”。本課題依據青海省高海拔、強紫外線和缺氧的地理環境，其居住人群長期暴露于強紫外線環境，導致皮膚光老化，本研究以皮膚角質形成細胞(HaCaT細胞)作為研究對象，采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、P38絲裂原激活蛋白激酶(P38MAPK)、P53、B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、Bcl-2相關X(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)水平，探討藏雪蓮多糖通過P38MAPK通路減輕中波紫外線輻射后HaCaT細胞的凋亡，進而減輕HaCaT細胞的炎性損傷，起到光老化的保護作用，為青藏高原藥材的開發和實際應用提供理論依據，同時為藏雪蓮對中波紫外線損傷的光保護作用機制研究提供理論基礎。

研究旨在探討SSB多糖是否通過P38絲裂原激活蛋白激酶(P38MAPK)通路減輕UVB輻射后HaCaT細胞的凋亡，進而抑制HaCaT細胞的炎癥，最終減輕UVB輻射后HaCaT細胞的氧化損傷，為SSB多糖對UVB損傷的光保護作用機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1.1 主要材料和儀器 2014年10月—2015年3月，SSB購自青海眾康醫藥連鎖有限公司，HaCaT細胞(人角質形成細胞株)購自南京凱基生物科技發展有限公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries，DMEM培養基購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司，胰酶購自北京索萊寶科技有限公司，IL-6檢測試劑盒及TNF-α檢測試劑盒購自武漢優爾生科技股份有限公司；P38MAPK、P53、Bcl-2、Bcl-2相關X(Bax)、Caspase-3酶聯免疫試劑盒均購自北京瑞格博科技發展有限公司；CO2培養箱購自上海力申科學儀器有限公司，IX71型Olympus倒置顯微鏡購自Olympus公司，TL20W/12紫外線UVB燈管購自德國飛利浦，UVB輻照度監視器購自臺灣路昌，酶標儀購自Bio-Rad，手持勻漿儀購自無錫沃信儀器有限公司，TS-100恒溫混勻儀購自杭州瑞誠儀器有限公司。

1.1.2 SSB多糖的提取 根據文獻[11-12]，準確稱取100 g SSB(經青海大學醫學院藥學系陳湘宏副教授鑒定)，加入95%乙醇(料液比為1∶12)，索氏提取法回流脫脂后，過濾，揮干有機溶劑后，濾渣加入一定比例蒸餾水(料液比為1∶12)，85 ℃水浴加熱2 h，每隔15 min攪拌1次，過濾后的上清液用95%乙醇以1∶3的比例沉淀，靜置過夜，回收上清液乙醇，沉淀用無水乙醇洗滌后干燥，得SSB多糖粗品。以含10% FBS的DMEM培養基為溶劑，配置成低劑量SSB多糖(10 mg/ml)及高劑量SSB多糖(40 mg/ml)，并用0.22 μm孔徑過濾器過濾，現配現用。

1.1.3 HaCaT細胞的培養 根據文獻[13]，HaCaT細胞以含10% FBS的DMEM為培養基(內含10 U/ml青霉素和10 U/ml鏈霉素)，接種于培養瓶后，置于37 ℃ 5% CO2培養箱，當細胞達90%融合時傳代(IX71型Olympus倒置顯微鏡觀察細胞形態)，取處于對數生長期3～5代的細胞用于實驗。

1.1.4 實驗分組 當HaCaT細胞達到85%～90%融合時，將培養瓶內的細胞按1×106/ml細胞濃度轉到6孔板中繼續培養。當細胞達80%～90%融合時，將細胞隨機分為2組，即將HaCaT細胞分為低劑量輻射組(30 mJ/cm2，A組，輻射1 h)和高劑量輻射組(60 mJ/cm2，B組，輻射1 h)；將A組和B組又分別分為對照組(1組)、輻射組(UVB，2組)、低劑量SSB多糖組(UVB+SSB 10 mg/ml，3組)，高劑量SSB多糖組(UVB+SSB 40 mg/ml，4組)。UVB輻射前1 h將HaCaT細胞用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，并加入不同濃度SSB多糖于細胞培養基中，對照組用錫紙包住置暗處，其他組細胞打開培養皿蓋在預設好的UVB輻射儀中照射1 h后，立即用無菌PBS洗3遍，并加含10% FBS的DMEM培養基繼續培養18 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 IL-6、TNF-α水平的檢測 采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法，按照IL-6檢測試劑盒及TNF-α檢測試劑盒說明書，將貼壁細胞用胰液消化，以1 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，收集細胞，并用冷0.01 mol/L PBS洗3次，用手持勻漿儀裂解細胞后以1500 r/min離心10 min(離心半徑12 cm)，吸取上清液為樣本，將100 μl不同濃度的標準品及樣品(各組細胞的上清液)加入酶標板，并加上覆膜；37 ℃溫育2 h，棄去液體，甩干后每孔加檢測溶液A工作液100 μl，加上覆膜；37 ℃溫育1 h，棄去液體，并用洗板機洗板3次，甩干后每孔加檢測溶液B工作液100 μl，加上覆膜；37 ℃溫育30 min，棄去液體，并用洗板機洗板5次，甩干后每孔加底物溶液90 μl，酶標板加上覆膜；37 ℃避光顯色15～25 min，每孔加終止溶液50 μl，酶標儀在450 nm波長測量各孔的吸光度并記錄結果，每組單獨重復測量5次，取均值。

1.2.2 P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3水平的檢測 按照P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3酶聯免疫試劑盒說明書，將貼壁細胞用胰液消化，以1 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，收集細胞，并用冷0.01 mol/L PBS洗3次，用手持勻漿儀裂解細胞后以1500 r/min離心10 min(離心半徑12 cm)，吸取上清液為樣本，除空白孔外，標準品孔和樣品孔分別加入不同濃度的標準品和樣品(各組細胞的上清液)50 μl，并加入酶標試劑50 μl，蓋上封板膜后，37 ℃孵育1 h，棄去液體，并用洗板機洗板5次，，每孔先加入顯色試劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μl，以空白孔調零后，酶標儀上選擇450 nm波長測定各孔吸光度并記錄結果，每組單獨重復測量5次，取均值。

通過高職院校學生實習過程管理與質量評價的研究，建立了一套生產性綜合實習課程標準、學生實習質量監控管理與評價辦法、學生生產實習考核辦法、相關生產實習原始資料，形成一個完整規范的學生實習管理系統，實習工作的管理水平逐步提高，學生畢業質量穩步提升，受到用人單位的好評。

2 結果

2.1 IL-6、TNF-α水平比較 A1組、A2組、A3組、A4組IL-6、TNF-α水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。A2組、A3組IL-6、TNF-α水平高于A1組，A4組TNF-α水平高于A1組，差異有統計學意義(P<0.05)；A3組、A4組IL-6、TNF-α水平低于A2組，差異有統計學意義(P<0.05)；A4組IL-6、TNF-α水平低于A3組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。B1組、B2組、B3組、B4組IL-6、TNF-α水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B2組、B3組IL-6、TNF-α水平高于B1組，B4組IL-6水平高于B1組，B4組TNF-α水平低于B1組，差異有統計學意義(P<0.05)；B3組、B4組IL-6、TNF-α水平低于B2組，差異有統計學意義(P<0.05)；B4組IL-6、TNF-α水平低于B3組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表1 A組IL-6、TNF-α水平比較(±s，pg/ml，n=5)

注：與A1組比較，aP<0.05；與A2組比較，bP<0.05；與A3組比較，cP<0.05；IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α

表2 B組IL-6、TNF-α水平比較(±s，pg/ml，n=5)

注：與B1組比較，aP<0.05；與B2組比較，bP<0.05；與B3組比較，cP<0.05

2.2 P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3水平比較 A1組、A2組、A3組、A4組P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。A2組P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于A1組，A2組Bcl-2水平低于A1組，A3組P38MAPK、Caspase-3水平高于A1組，A4組Bcl-2水平高于A1組，差異有統計學意義(P<0.05)；A3組、A4組P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于A2組，Bcl-2水平高于A2組，差異有統計學意義(P<0.05)；A4組Bcl-2水平高于A3組，Caspase-3水平低于A3組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。B1組、B2組、B3組、B4組P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B2組P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于B1組，B2組、B3組Bcl-2水平低于B1組，B4組Bcl-2水平高于B1組，B4組Caspase-3水平低于B1組，差異有統計學意義(P<0.05)；B3組、B4組P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于B2組，Bcl-2水平高于B2組，差異有統計學意義(P<0.05)；B4組Bcl-2水平高于B3組，Caspase-3水平低于B3組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表3 A組P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3水平比較(±s，n=5)

注：與A1組比較，aP<0.05；與A2組比較，bP<0.05；與A3組比較，cP<0.05；P38MAPK=P38絲裂原激活蛋白激酶，Bcl-2=B細胞淋巴瘤因子2，Bax=Bcl-2相關X，Caspase-3=半胱氨酸蛋白酶3

表4 B組P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3水平比較(±s，n=5)

注：與B1組比較，aP<0.05；與B2組比較，bP<0.05；與B3組比較，cP<0.05

3 討論

皮膚衰老是一個復雜、多因素綜合作用的過程，通常分為內源性衰老和外源性衰老兩種，前者即自然衰老，后者是由環境因素如紫外線、吸煙、風吹等引起的外源性老化，又稱皮膚光老化[14]。UVB是引起皮膚光老化的最重要因素，主要損傷HaCaT細胞。既往研究證實，UVB輻射后可升高IL-6、TNF-α水平[2-3]，降低線粒體膜電位，升高細胞內游離Ca2+濃度[4]，激活P38激酶[5-7]，特異地降低Bcl-2[8]的表達水平，引起Caspase級聯反應，引起細胞凋亡[9]。本研究主要通過ELISA法探討HaCaT細胞經UVB輻射后炎性因子(IL-6、TNF-a)以及凋亡相關因子(P38MAPK、P53、Bax、Bcl-2、Caspase-3)的表達情況，以此來探討SSB多糖是否能通過P38MAPK通路減輕UVB輻射后HaCaT細胞凋亡，進而減輕HaCaT細胞的炎性損傷，最終減輕UVB輻射后HaCaT細胞的氧化損傷。

本研究結果顯示，A2組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于A1組，Bcl-2水平低于A1組；A3組IL-6、TNF-α、P38MAPK、Caspase-3水平高于A1組；A4組TNF-α、Bcl-2水平高于A1組；A3組、A4組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于A2組，Bcl-2水平高于A2組；A4組IL-6、TNF-α、Caspase-3水平低于A3組，Bcl-2水平高于A3組；B2組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平高于B1組，Bcl-2水平低于B1組；B3組IL-6、TNF-α水平高于B1組，Bcl-2水平低于B1組；B4組IL-6、Bcl-2水平高于B1組，TNF-α、Caspase-3水平低于B1組；B3組、B4組IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平低于B2組，Bcl-2水平高于B2組；B4組IL-6、TNF-α、Caspase-3水平低于B3組，Bcl-2水平高于B3組。說明SSB多糖能夠減少UVB輻射HaCaT細胞后IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bax、Caspase-3水平，升高Bcl-2水平，且IL-6、TNF-α、Bcl-2蛋白及Capase-3蛋白效果呈劑量依賴性[14]。間接證明了SSB多糖能夠緩解UVB輻射后HaCaT細胞凋亡，進而減輕HaCaT細胞的炎性損傷，最終緩解UVB輻射后HaCaT細胞的氧化損傷。

但本研究未做IL-6、TNF-α、P38MAPK、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3的Western blotting及免疫組化或免疫熒光檢測，亦未做以上蛋白通路的抑制劑，因此不能直接證明SSB多糖減輕UVB輻射后HaCaT細胞的炎性損傷是通過P38MAPK通路，但卻為SSB多糖減輕UVB輻射后HaCaT細胞氧化損傷的機制探討提供新的方向。

綜上所述，SSB多糖是通過P38MAPK通路減少UVB輻射后HaCaT細胞的凋亡，進而抑制IL-6、TNF-α的表達，抑制HaCaT細胞的炎癥，最終減輕UVB輻射后其氧化損傷。為進一步探討SSB多糖對UVB損傷的光保護作用的機制研究提供理論基礎。

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(本文編輯：崔麗紅)

·世界全科醫學工作瞭望·

Alleviation of Inflammatory Damage Induced by the Apoptosis of HaCaT Cells After Ultraviolet B Radiation bySaussureaTridactylaSch.-Bip. Polysaccharides Through P38MAPK Passage

GUOYan,SUNJuan,WANGLi-wen.

DepartmentofDermatologyandVenereology,AffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining810001,China

Objective To investigate whetherSaussureaTridactylaSch.-Bip.(SSB) polysaccharides could alleviate inflammatory damage induced by the apoptosis of HaCaT cells after ultraviolet B (UVB)radiation through P38MAPK passage.Methods From October 2014 to March 2015, SSB polysaccharideswere extracted, and HaCaT cells were cultured in vitro and were respectively divided into low dose radiation group (30 mJ/cm2, radiation 1 h,group A), high dose radiation group (60 mJ/cm2, radiation 1 h, group B).Each of the two groups were further divided into control group (group 1), UVB radiation group (UVB,group 2), low dose SSB polysaccharide group (UVB+SSB 10 mg/ml, group 3), high dose SSB polysaccharide group (UVB+SSB 40 mg/ml, group 4).ELISA method was used to test and compare the levels of IL-6, TNF-α, P38MAPK, P53, Bcl-2, Bax and Caspase-3.Results Group A2 was higher (P<0.05) in the levels of IL-6, TNF-α, P38MAPK, P53, Bax and Caspase-3 and lower (P<0.05) in the level of Bcl-2 than group A1;group A3 was higher (P<0.05) than group A1 in the levels of IL-6, TNF-α, P38MAPK and Caspase-3;group A4 was higher (P<0.05) than group A1 in the levels of TNF-α and Bcl-2;group A3 and group A4 were lower (P<0.05) in the levels of IL-6, TNF-α, P38MAPK, P53, Bax and Caspase-3 and higher (P<0.05) in the level of Bcl-2 than group A2;group A4 was lower (P<0.05) in the levels of IL-6, TNF-α and Caspase-3 and higher (P<0.05) in the level of Bcl-2 than group A3.Group B2 was higher (P<0.05) in the levels of IL-6, TNF-α, P38MAPK, P53, Bax and Caspase-3 and lower (P<0.05) in the level of Bcl-2 than group B1;group B3 was higher (P<0.05) in the levels of IL-6 and TNF-α and lower (P<0.05) in the level of Bcl-2 than group B1;group B4 was higher (P<0.05) in the levels of IL-6 and Bcl-2 and lower (P<0.05) in the level of TNF-α and Caspase-3 than group B1;group B3 and group B4 were lower (P<0.05) in the levels of IL-6, TNF-α, P38MAPK, P53, Bax and Caspase-3 and higher (P<0.05) in the level of Bcl-2 than group B2;group B4 was lower (P<0.05) in the levels of IL-6, TNF-α and Caspase-3 and higher (P<0.05) in the level of Bcl-2 than group B3.Conclusion SSB polysaccharides could alleviate inflammatory damage induced by the apoptosis of HaCaT cells after UVB radiation through P38MAPK passage.

Ultraviolet rays;SaussureaTridactylaSch.-Bip. polysaccharides;HaCaT cells;Interleukin-6;Tumor necrosis factor-alpha;Mitogen-activated protein kinases;Lymphoma, B-cell;Bcl-2-associated X protein;Cysteine proteases

青海省(應用)基礎研究計劃項目(2013-Z-730)

810001 青海省西寧市，青海大學附屬醫院皮膚病與性病科(郭硯)；青海大學研究生院(孫娟，王麗雯)

郭硯，810001 青海省西寧市，青海大學附屬醫院皮膚病與性病科；E-mail：qhguoyan@163.com

R 122.25

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.27.012

2015-03-12；

2015-07-09)

雪蓮有20余種，絕大部分產于我國青藏高原及其毗鄰地區，即藏雪蓮(SaussureaTridactylaSch.-Bip.，SSB)，屬菊科鳳毛菊屬(Saussurea DC)雪蓮亞屬的草本植物，經現代化學成分分析，雪蓮是珍貴的藥用植物，含有揮發油、生物堿、甾醇、黃酮類、酚類、糖類、鞣質原糖和16種氨基酸、雪蓮內酯以及鉀、鈣、鋅、鐵、鎂等元素，具有較高的營養價值。有文獻報道，SSB多糖由7種單糖組成：木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖[1]。

皮膚每天均接受著來自日光中紫外線的輻射，長期的紫外線輻射將導致皮膚發生形態學、組織學和生理學的改變，稱之為光老化。中波紫外線(ultraviolet B，UVB，280～319 nm)是引起輻射損傷的最重要因素，且主要損傷皮膚角質形成細胞(HaCaT細胞)。業已證實，UVB輻射后可使白介素6(interleukin，IL-6)[2]、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)[3]水平過高，引起HaCaT細胞的炎性損傷，其進一步可降低線粒體膜電位，升高細胞內游離Ca2+濃度[4]，進而激活絲裂原激活蛋白激酶信號通路，激活P38激酶[5-7]，抑制B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)的表達[8]，進而引起半胱氨酸蛋白酶(Caspase)級聯反應，水解一系列蛋白底物，引起細胞凋亡[9]，最后導致UVB輻射后HaCaT細胞的氧化損傷。