沙棘抗氧化片對小鼠的抗氧化作用

楊黎彬 賈敏 劉少靜 刁穎博 張玉琪 肖秋茹

自由基學說表明人體的許多疾病和衰老與氧自由基作用有關，氧化反應與人體健康密切相關，多種疾病都是由于人體氧化反應導致［1］。現代醫學研究表明隨著年齡的增長，抗氧化酶類活性下降，體內過量的自由基就會引起脂質過氧化，影響細胞功能，進而導致疾病和衰老［2］。通過獲取天然抗氧劑來應對自由基的損傷是一條重要的途徑，食用功能性的抗氧化功能食品是極為方便有效的補充內源性抗氧化劑的方法。本研究的沙棘抗氧化片由沙棘提取物與葡萄籽提取物以一定比例混合加入相應的輔料壓片制成，具有純度高的優點，并且沙棘中的黃酮類、多酚類成分及維生素等成分與葡萄籽中的原花青素成分共同作用能達到較好的抗氧化保健功效。本研究的目的是探討沙棘抗氧化片的體內抗氧化作用。本研究參照中國食品藥品監督管理局2012年發布的抗氧化功能評價方法［3］，以乙醇誘導的氧化損傷小鼠模型進行小鼠體內抗氧化功能的研究，從小鼠血漿及肝組織的抗氧化酶SOD、GSH-Px活性、GSH的含量和脂質過氧化產物MDA的含量幾個方面驗證沙棘抗氧化片的抗氧化功效，為其進一步開發保健食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品 沙棘抗氧化片由西安醫學院藥學院自制，批號20120518。臨用前沙棘抗氧化片磨粉，蒸餾水溶解，配制成所需濃度，4℃保存，給藥前水浴加熱至37℃。

1.2 動物 昆明種小鼠50只，體重為25～30 g，雌雄各25只，由第四軍醫大學動物中心提供，合格證號:SCXK(陜)2007-007。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器:ELx808型酶標儀(美國 BioTek公司)，722型分光分度計(上海第三分析儀器廠)，微量加樣器(德國Eppendorf公司)，YQ-3型電動勻漿機(金壇市文化儀器有限公司)，KY91旋渦振蕩器(北京凱云儀科技有限公司)，GL-25M高速冷凍離心機(上海瀘湘儀離心機有限公司)。

1.3.2 試劑:冰醋酸，95%乙醇，氯仿，磷酸鹽緩沖液等;還原性谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組:取8周齡小鼠，體重25～30 g，隨機分成5組，每組10只，設為空白對照組、模型對照組、樣品低劑量組、樣品中劑量組、樣品高劑量組。

1.4.2 動物造模及飼養:模型對照組和3個受試樣品劑量組按相當于人體推薦量的5、10、20倍的劑量灌胃，即 0.192 g/kg、0.383 g/kg、0.766 g/kg。空白和模型對照組灌服等量的蒸餾水。連續灌胃30 d，每周記錄食量及體重。動物房溫度保持在(24.0±0.5)℃，相對濕度保持在(65±5)%。室內照明包括光明與黑暗的12 h交替。末次灌胃后，模型組對照組和3個劑量組禁食16 h(過夜)，然后1次性灌胃給予50%乙醇12 ml/kg，6 h后取材(空白對照組不作處理，不禁食取材)［15］。

1.4.3 動物血液及肝組織的采集:在飼養結束時，小鼠用乙醚麻醉，解剖收集血液并取肝組織。各組稱取適量肝臟組織，加入9倍體積的預冷勻漿緩沖液(根據所測指標選擇0.9%氯化鈉溶液或特殊緩沖液)，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液電動勻漿(1 500 r/min，2 min)，3 000 r/m 離心15 min，上清液分裝后 －80℃保存備用。

1.4.4 指標測定:血清和肝臟組織中MDA含量用TBA比色法測定，SOD活性用羥胺法測定，GSH、GSHPx用5，5’-二硫對硝基苯甲酸(DTNB)法測定。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，獨立樣體t檢驗，組間顯著性采用F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 沙棘抗氧化片對乙醇導致的氧化損傷模型小鼠血清中和肝臟組織勻漿中MDA和GSH的影響 模型組小鼠血清與肝臟組織的MDA含量與空白對照組相比顯著升高，GSH含量與空白對照組相比顯著降低，說明建模成功。樣品中、高劑量組小鼠血清和肝組織中MDA含量顯著低于模型對照組(P＜0.05或＜0.01)，GSH含量顯著高于模型對照組(P＜0.05或＜0.01)。說明沙棘抗氧化片中、高劑量可以很好地保護小鼠體內清除過氧化物的能力。見表1。

表1 沙棘抗氧化片對血清中和肝臟組織勻漿中MDA和GSH的影響n=10，±s

表1 沙棘抗氧化片對血清中和肝臟組織勻漿中MDA和GSH的影響n=10，±s

注:與空白對照組比較，*P ＜0.01;與模型對照組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別MDA血清中(nmol/ml) 肝組織勻漿中(nmol/mg-Protein)GSH(mgGSH/Lg-Protein)血清中(nmol/ml) 肝組織勻漿中(nmol/mg-Protein)空白對照組5.83 ±1.81 4.58 ±1.88 6.58 ±2.28 4.62 ±1.28模型對照組 8.81 ±2.34* 6.67 ±1.72* 3.57 ±1.19* 3.26 ±0.73*樣品低劑量組 6.39±2.84 3.34±1.61△ 4.12±1.51 4.50±1.99#樣品中劑量組 6.41±3.05# 3.39±1.21△ 5.91±2.74△ 5.63±2.13△樣品高劑量組 5.89±2.20△ 3.44±1.84# 5.93±2.03△ 5.58±2.02△

2.2 沙棘抗氧化片對乙醇導致的氧化損傷模型小鼠血清中和肝臟組織勻漿中SOD和GSH-PX活性的影響 與空白對照組相比，模型對照組小鼠血清與肝臟組織的SOD和GSH-Px活性顯著降低，說明建模成功。經口給予小鼠沙棘抗氧化片30 d，與模型對照組相比，高劑量組小鼠血清和肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著高于模型對照組(P＜0.05或＜0.01)。說明沙棘抗氧化片可以起到抗氧化的作用，能有效地保護小鼠機體。見表2。

表2 沙棘抗氧化片對血清中和肝臟組織勻漿中SOD和GSH-PX活性的影響n=10，±s

表2 沙棘抗氧化片對血清中和肝臟組織勻漿中SOD和GSH-PX活性的影響n=10，±s

注:與空白對照組比較，*P ＜0.01;與模型對照組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 SOD(U/mg-Protein)血清中 肝組織勻漿中GSH-PX(活力單位)血清中 肝組織勻漿中空白對照組 39.00 ±5.74 581.05 ±117.99 464.06 ±11.85 1887.25 ±354.71模型對照組 31.33 ±6.82 435.17 ±126.20* 325.38 ±82.10* 1 426.15 ±325.79*樣品低劑量組 33.82 ±7.12 475.45 ±115.74 366.93 ±143.26 1 407.22 ±445.47樣品中劑量組 37.52 ±5.85# 549.69 ±142.48# 396.15 ±82.42# 1 624.52 ±703.21樣品高劑量組 40.36 ±6.83△ 567.47 ±134.49# 452.31 ±103.78△ 1 922.69 ±500.33△

3 討論

沙棘是生長在我國華北、西北和東北地區的一種野生落葉灌木，富含生物活性物質。研究表明沙棘富含以異鼠李素、槲皮素、山柰酚為母核，糖元為葡萄糖、鼠李糖、槐糖等的黃酮類化合物，現已從沙棘植物中分離到49種黃酮類化合物［4］。沙棘中含有三十余種包括沒食子酸、兒茶素為母核的多酚類化合物，這些多酚類化合物具有抗氧化、保護細胞、保護心臟及促進傷口愈合等作用［5］。沙棘有維生素“源”植物的美稱，富含維生素C、E。黃酮類、多酚類化學成分及維生素C、E等成分具有較強的抗氧化作用［6］。實驗證明沙棘具有很強的抗氧化活性［7－10］。葡萄籽提取物的主要功能成分是原花青素，原花青素含有大量的活性酚羥基，是氫的供體，能有效地清除多種活性氧自由基，影響某些酶的生物活性，具有極強的抗氧化活性。國內外各種體外試驗及動物實驗研究證實葡萄籽提取物原花色素具有很強的抗氧化活性，是一種很好的氧自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑，可對氧化損傷起到保護作用，且其保護作用優于其他抗氧化劑［11－15］。以沙棘為主要原料開發的保健食品眾多，但目前獲得國家食品藥品監督管理總局批準的有抗氧化功效的保健食品僅有極少數幾種，這類產品具有較大的開發空間。另外，這類產品組方多為沙棘與有抗氧化功效的中藥配伍，存在純度低、服用量大的問題。

正常情況下，體內氧自由基的產生和清除處于動態平衡狀態。當自由基產生過多或通過內源性的抗氧化成分對自由基清除減少，如SOD和GSH-Px活性降低，體內氧自由基代謝就會出現失衡，造成自由基過剩。過量自由基可通過過氧化作用攻擊細胞膜及核酸、蛋白質和酶類等生物大分子，造成生物膜的結構損傷和功能障礙，DNA基因突變或復制異常及生物酶活力下降，最終導致細胞功能嚴重受損以至衰老、死亡［16］。隨著年齡的增長，機體內自由基防御系統如SOD、GSH-Px等活性下降，這種平衡逐漸被破壞。MDA是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發的脂質過氧化作用的最終分解產物，其含量可間接判斷體內自由基對機體的損傷程度以及衰老的程度與脂蛋白交聯有毒性作用，其水平高低能直接反應脂質過氧化程度以及機體的抗氧化能力。測定血清中MDA含量，可以間接反映細胞受氧化損傷的程度［17］。機體抗氧化防御體系中 SOD對氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，SOD能及時清除機體生成的過量自由基，從而保護細胞免受氧自由基的攻擊，因而SOD活力的高低可間接反映機體清除氧自由基的能力［18］。GSH-Px是機體廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它能催化GSH變為氧化型谷胱甘肽GSSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進H2O2的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害［19］。GSH是一種由3個氨基酸組成的小分子肽，它作為體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，如與自由基、重金屬等結合，從而把機體內有害的毒物轉化為無害的物質，排泄出體外。因此，測定血清中GSH-Px和SOD的活性，以及MDA、GSH含量，可以間接反映機體清除自由基的能力，觀察體內的氧化損傷情況。

本實驗利用乙醇誘導的氧化損傷小鼠模型，與空白對照組相比，模型對照組小鼠抗氧化指標差異顯著(P＜0.01)，說明該方法建立的小鼠氧化損傷模型效果良好，可應用于抗氧化實驗。本實驗中喂服沙棘抗氧化片的中、高劑量組小鼠與模型對照組小鼠比較，血清和肝組織中MDA水平均顯著降低，SOD和GSH-Px活性顯著升高，抗氧化物質GSH含量顯著增加，表明沙棘抗氧化片具有較好的抗氧化功能，具有進一步開發為保健食品的價值。

1 趙克默主編.氧自由基與臨床.第1版.北京:中國醫藥科技出版社，2000.

2 趙寶路主編.氧自由基和天然抗氧化劑.第1版.北京:科學出版社，1999.

3 關于印發抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知.國食藥監保化［2012］107號.

4 劉勇，廉永善.王穎莉沙棘的研究開發評述及其重要意義.中國中藥雜志，2014，39:1547-1552.

5 Panossian A，Wagner H.From traditional to evidence-based use of Hippophae rhamnoides chemical composition，experimental，and clinical pharmacology of sea buckthorn berries and leavesextracts.Munich:Springer Vienna，2013.

6 Chen C，Xu XM，Chen Y，et al.Identification，quantification and antioxidant activity of aocylated flavonol glycosides from sea buckthorn(Hippophae rhamnoides ssp.sinensis).Food Chem，2013，141:1573-1579.

7 Yang BR，Kallio H.Composition and physiological effects of seabuckthorn(Hippophae)lipids.Trends Food Sci Tech，2002，13:160.

8 金海英.沙棘籽原花青素提取單因素實驗研究.沙棘雜志，2005，8:351-371.

9 陳麗娜，吳瓊.沙棘籽及果皮渣黃酮粗提物抗氧化作用研究.食品研究與開發，2011，10:51-53.

10 楊現艷，瞿偉菁，徐自良，等.沙棘籽渣黃酮對更年期大鼠血脂及體內抗氧化系統的影響.中國中藥雜志，2006，31:1109-1112.

11 劉玉梅，張自強，鄧雯，等.葡萄籽原花青素對小鼠腦組織氧化損傷的保護作用.食品科學，2009，21:374-376.

12 豐佃娟，徐貴發.葡萄籽提取物抗氧化功能的實驗研究.食品與藥品，2007，11:16-18.

13 劉向榮，鄧銀華，劉文，等.葡萄籽多酚性成分對小鼠抗氧化作用研究.中國藥學雜志，2010，45:835-837.

14 Saint CD，Gaulejac N，Provoab C，et al.Polyphenol profileof French cider apple varieties.Agric Food Chem，1999，7:425.

15 豐佃娟，徐貴發.葡萄籽提取物對人體抗氧化能力的影響.山東大學學報 (醫學版)，2007，45:985-987.

16 戴士勇.人類的衰老與抗衰老.中國醫藥，2006，1:764-765.

17 Harman D.Free radical theory of aging:free radicals in biology.New York:Academic Press，1982.255-259.

18 牛育鴻，陳婭萍.運動、自由基與衰老研究.榆林學院學報，2009，19:17-19.

19 Chisolm GM，Steinberg D.The oxidative modification hypothesis of atherogenesis:An overiew.Free Radical Biological Medicine，2000，28:1815-1826.