腦心通膠囊的HPLC指紋圖譜研究及成分含量測定

蘇航 何劍波 侯沛紅 康小剛

腦心通膠囊是由黃芪、赤芍、丹參、當歸、川芎、桃仁、紅花、牛膝、桂枝等16味中藥制成的復方制劑，具有益氣活血、化瘀通絡的功效，用于中風所致半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜，舌強語謇及胸痹所致胸悶、心悸、氣促等。近年我院常用該藥效果較好，尤其對改善中風后的肢體麻木，口眼歪斜，效果較好。方中含量最多的藥材是黃芪，其次丹參、當歸、紅花等［1］。為了表征該方中的主要有效成分，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法對其進行分析，參照中藥注射劑指紋圖譜的有關技術要求［2］進行試驗;同時對該制劑中4個功效成分即黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、羥基紅花黃色素A進行定量分析。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，附 LC-20AD雙泵，SPDM20A二極管陣列檢測器，SIL-20ACHT自動進樣器，CTO-20A柱溫箱，LC/Labsoluion色譜工作站，日本島津公司;電子分析天平，1/10萬g，型號ME235S，德國塞多利斯公司;SK250-LHC超聲波發生器，上海科導超聲儀器有限公司。乙腈、甲醇，色譜級，美國Honeywell公司;水為自制超純水，由Millipore純水儀，美國millipore公司;其余為分析純。黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷、丹酚酸B、羥基紅花黃色素A對照品均購自中國藥品生物制品檢定所;腦心通膠囊(批號20140224、20140225、20140226、201400301、20140302、20140306、20140309、20140033、20140316、2014018)，陜西步長制藥有限公司。

2 指紋圖譜測定方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm，瑞士 Kromasil公司);流動相:乙腈(A)－0.6%磷酸水溶液溶液(B)，梯度洗脫，0 ～30 min，A 10%→25%;30～60 min，A 25%→60%:60～65 min，A 60%→67%;65～75 min，A67%;75～95 min，A 67%→100%。記錄時間為 95 min。體積流量:0.8 ml/min;柱溫:30℃;檢測波長:322 nm;進樣20 μl。

2.2 參比物與供試品溶液的制備

2.2.1 參比物溶液的配制:精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加流動相制成質量濃度為100 μg/ml的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品的制備:取10粒本品內容物，混勻，稱取1.0 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加80%甲醇適量，超聲 30 min，放涼，加 80%甲醇至刻度，濾過(0.45 μm 濾膜)，濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗:取供試品溶液(批號20140224)，連續進樣6次，分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD小于1.0%;相對峰面積RSD小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗:取供試品溶液(批號20140224)，分別于 0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，考察共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間 RSD小于1.0%，相對峰面積 RSD小于2.0%，表明供試品在24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗:取供試品(批號20140224)6份，分別按供試品溶液的制備與檢測方法進行檢測，分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察。結果表明，各共有峰相對保留時間RSD小于1.0%，相對峰面積RSD小于2.0%，表明重復性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立與相似度分析:取10批樣品，分別按供試品溶液的制備與檢測方法進行檢測，進樣20 μl，記錄指紋圖譜，峰10為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，建立指紋圖譜。10批樣品共有色譜峰的相對保留時間的RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，符合指紋圖譜研究技術的要求。運用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”對10批腦心通膠囊的指紋圖譜進行相似度分析，首先將色譜工作站數據導入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，選定33個共有峰進行譜峰匹配，通過中位數矢量計算得出樣品指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為標準，進行整體相似度評價，結果相似度為0.954～0.992，表明這10批腦心通膠囊的化學成分一致性較好。見圖 1、2。

圖1 腦心通膠囊HPLC指紋圖譜

圖2 10批腦心通膠囊的HPLC指紋圖譜

3 含量測定方法與結果

3.1 色譜條件 除黃芪甲苷的檢查波長為203 nm外，其余均同色譜條件“2.1”項。

3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取羥基紅花黃色素對照品6.0 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷6.0 mg、丹酚酸 B 7.5 mg、黃芪甲苷 7.5 mg，分別置于各 5 ml量瓶中，分別加80%甲醇至刻度，搖勻，即得各對照品溶液。再分別精密量取羥基紅花黃色素對照品溶液1.00 ml、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液 0.01 ml、丹酚酸對照品溶液 1.00 ml、黃芪甲苷對照品溶液0.05 ml置10 ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液的母液。

3.3 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項。

3.4 線性關系的考察 分別精密量取混合對照品母液0.13、0.26、0.52、0.67、1.0 ml對照品溶液分別置于1 ml量瓶中并加80%甲醇稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得5個濃度組，進樣。分別以各對照品的濃度(x)為橫坐標，峰面積積分值(y)為縱坐標繪制標準曲線，計算，得回歸方程。見表1。

表1 各對照品的線性方程及其濃度范圍

3.5 精密度試驗 精密吸取上述線性對照品溶液(線性樣品:0.52 ml母液)，重復進樣5次，測得羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黃芪甲苷的相對標準差(RSD)分別為 1.21%，1.12%，1.08%，1.02%，1.52%，表明儀器精密度良好。

3.6 重復性試驗 精密稱取樣品(批號20140224)5份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品，按“2.2.1”項下條件測定。結果:羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黃芪甲苷平均含量與RSD值分別為 0.422mg/g、1.22%，0.036 mg/g、1.31%，2.396 mg/g、1.21%，0.078 mg/g、1.14%，表明該方法重復性良好。

3.7 穩定性試驗 精密吸取上述線性對照品溶液(線性樣品:0.52 ml母液)，在第 0、2、4、8、12、24 h 進樣。結果:羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸 B、黃芪甲苷的峰面積的 RSD值分別為1.01%、1.34%、1.08%、1.27%、1.42%，表明該溶液在24 h內穩定。

3.8 加樣回收率試驗 取腦心通膠囊(批號20140224，其中羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸 B、黃芪甲苷分別為 0.422、0.036、2.396、0.078 mg/g)10 粒內容物，混勻，稱取粉末 1.0 g，精密稱定，分別添加混合對照品溶液(精密稱取丹酚酸B對照品溶液22.5 mg置于5 ml量瓶中，再分別精密量取“3.2”項下線性對照品溶液濃度為1.2 mg/ml羥基紅花黃色素 A 1.5 ml、1.2 mg/ml毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.15 ml、1.5 mg/ml黃芪甲苷 0.15 ml于量瓶，加80%甲醇至刻度)0.25、0.50、1.00 ml，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，重復制樣6份，按照“3.1”項下色譜條件測定。見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

3.9 含量測定 精密稱10批樣品，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品，按“2.2.1”項下條件測定。結果，羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B、黃芪甲苷含量(mg/粒，0.4 g/粒)分別為 0.169、0.014、0.965 和 0.032 mg/粒，RSD(%)分別 1.37、1.67、0.95 和 1.57%。

4 討論

4.1 波長的選擇 采用全波長對腦心通膠囊樣品進行測定，并采集其三維色譜圖，通過綜合考慮該三維色譜圖在所有波長下出峰的多少，和各成分的分離情況以及各色譜峰的豐度，最后選定322 nm作為指紋圖譜定性與羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、丹酚酸B定量的波長，而在此波長下黃芪甲苷吸光度太小，因此依據文獻［3］選擇203 nm作為其定量波長。

4.2 洗脫系統的選擇 由于等度洗脫，各成分分離度小或不能分開，所以選擇梯度洗脫。并對不同流動相系統(甲醇-水、乙腈-水、乙腈－1.0%醋酸水溶液以及乙腈－0.6%磷酸水溶液)及其不同流動相比例進行了比較，結果以乙腈－0.6%磷酸水溶液系統為最佳，其圖譜上各個色譜峰的分離度較好，保留時間適中，因此選此流動相系統作為腦心通膠囊HPLC指紋圖譜檢測的流動相。

4.3 制樣方法 依據文獻［4］，比較了不同溶劑(甲醇、水)、不同提取方(超聲、即熱回流、浸漬)、不同濃度的甲醇(50%、60%、70%、80%、90%)等。結果表明:80%甲醇超聲30min提取，得峰面積較大、峰個數較多、分離度較好。

4.4 檢測成分的選擇 依據文獻［1］，黃芪是處方中含量最高的藥材，其主要活性成分為黃芪甲苷［5］、毛蕊異黃酮葡萄糖苷［6］等，同時該制劑對兩種成分分析報導較少。另外還檢測了含量較高的其他藥材中的兩個成分以達到制劑質量控制的目的。

通過上述指紋圖譜及對照品比對初步分析，發現眾多有效成分且部分含量較高，所以臨床效果較好。同時通過該制劑HPLC指紋圖譜分析與10批次制劑中的4個物質含量測定，結果含量均一。鑒于上述兩方法準確、穩定、操作簡單易于實施，因此兩方法均可用于作為腦心通膠囊的質量評價方法。

1 WS-10001(ZD-0001)-2002.中成藥標準匯編-腦系經絡肢體分冊.2002，225.

2 關于印發≤中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》的通知.中國藥品標準，2000，1:3-4.

3 閔慶璐，張世軒，陳曉明.HPLC－UV法測定丹黃祛瘀片中黃芪甲苷的含量.中華中醫藥學刊，2011，29:1678-1681.

4 李耿，孟繁蘊，楊洪軍，等.UPLC法同時測定腦心通膠囊中5個成分的含量.藥物分析雜志，2013，33:414-418.

5 劉天一，何觀虹，姚麗.黃芪甲苷治療心血管疾病研究進展.中醫藥信息，2013，30:117-121.

6 趙曉莉，潘鵬，周樂，等.毛蕊異黃酮葡萄糖苷大鼠在體腸吸收動力學的研究.南京中醫藥大學學報，2012，28:552-554.