母體肢體缺血預處理對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元線粒體結構和功能的影響*

盧　歡，鄭曉春，陳小琳，吳希珠，鄭官林

(1福建省婦幼保健院麻醉科，2福建醫科大學省立臨床學院，3福建省立醫院麻醉科，福建福州350001)

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母體肢體缺血預處理對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元線粒體結構和功能的影響*

盧歡1，2，鄭曉春2，3△，陳小琳1，吳希珠1，2，鄭官林1，2

(1福建省婦幼保健院麻醉科，2福建醫科大學省立臨床學院，3福建省立醫院麻醉科，福建福州350001)

［摘要］目的:探索母體肢體缺血預處理(LIP)對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元線粒體結構和功能的影響。方法:將孕20 d的40只SD大鼠隨機分為假手術組(S組)、LIP對照組、胎鼠宮內窘迫組(FD組)和LIP+ FD組。通過實驗設計建立胎鼠宮內窘迫模型，觀察各組胎鼠海馬CA1區線粒體超微結構的變化;檢測海馬線粒體跨膜電位變化;測定海馬組織活性氧簇(ROS)、三磷酸腺苷(ATP)、丙二醛(MDA)含量及錳-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性變化。結果: (1)與S組比較，FD組和LIP+ FD組電鏡下觀察胎鼠海馬CA1區線粒體呈不同程度破壞，線粒體膜電位下降，ATP含量和Mn-SOD活性降低，ROS和MDA含量增加(P＜0.05)。(2)與FD組比較，LIP+ FD組胎鼠海馬CA1區線粒體的超微結構保持較好的完整性，線粒體膜電位明顯提高，海馬ATP含量和Mn-SOD活性顯著增高，ROS和MDA含量減少(P＜0.05)。結論:母體肢體缺血預處理對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元線粒體功能具有保護作用。

［關鍵詞］肢體缺血預處理;胎兒缺氧/復氧損傷;線粒體

［修回日期］2015-04-22

Effects of maternal limb ischemic preconditioning on structural and functional changes of mitochondria in fetal hippocampal neurons induced by intrauterine distress-reoxygenation in rats

LU Huan1，2，ZHENG Xiao-chun2，3，CHEN Xiao-lin1，WU Xi-zhu1，2，ZHENG Guan-lin1，2
(1Department of Anesthesiology，Fujian Maternity and Children Health Hospital，2Provincial Clinical Medical College，Fujian Medical University，3Department of Anesthesiology，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China.E-mail: zhengxc2@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effects of maternal limb ischemic preconditioning (LIP) on the mitochondrial structures and functions of the hippocampal neurons induced by reoxygenation in the intrauterine distress fetal rats.METHODS: Pregnant rats (n=40) were randomly divided into 4 groups: sham (S) group，LIP group，fetal distress (FD) group and LIP+ FD group.Intrauterine ischemia model was established through the experimental design.The ultrastructure of the mitochondria in CA1 area of the hippocampus was observed.The mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) were measured.The content of ATP and MDA in the hippocampus tissue was detected.The activity of Mn-SOD was observed.RESULTS: Compared with sham group，the ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the hippocampus was damaged in FD group and LIP+ FD group.The mitochondrial membrane potential，the content of ATP and the activity of Mn-SOD were decreased.However，the content of ROS and MDA was increased.Compared with FD group，the ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the hippocampus was intact in LIP+ FD group.Furthermore，the reduced mitochondrial membrane potential and ATP content were inhibited.The activity of Mn-SOD was increased，but the content of ROS and MDA was decreased in LIP+ FD group.CONCLUSION: Limb ischemia preconditioning inhibits the damage the mitochondria of fetal hippocampal neurons induced by reoxygenation in the intrauterine distress fetal rats.

［KEY WORDS］Limb ischemia preconditioning; Fetal hypoxia/reoxygenation injury; Mitochondria

胎兒宮內窘迫是胎兒圍產期死亡及新生兒神經系統后遺癥的常見原因，嚴重威脅圍產兒的健康［1］。胎兒宮內窘迫后應盡快恢復胎兒血流灌注，這缺氧/復氧過程對胎兒可造成缺血/再灌注損傷。肢體缺血預處理(limb ischemic preconditioning，LIP)即通過肢體的短時間缺血預處理，對缺血/再灌注損傷的遠隔臟器如心、腦等產生內源性保護作用［2］。本研究建立胎鼠宮內窘迫模型，對孕鼠(母體)行LIP，以胎鼠(子體)海馬線粒體為研究目標，通過對胎鼠海馬線粒體結構及相關功能方面觀察，探討母體LIP是否能夠通過胎盤屏障對宮內窘迫胎鼠缺血/再灌注損傷起保護作用。

材料和方法

1實驗動物

清潔級成年SD大鼠56只，其中雌性42只，雄性14只，體重250～280 g，由福建醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號為SCXK(閩) 2012-0001。按雌雄比例3∶1于前1晚合籠，次日晨8點陰道涂片檢查法確定交配后即可確定為孕1 d，孕20 d時隨機抽取40只進行實驗。

2模型構建與實驗分組

2.1胎鼠宮內窘迫(fetal distress，FD)模型構建

取孕20 d大鼠麻醉后下腹正中切開，以無損傷小動脈夾鉗夾近子宮處雙側子宮動靜脈和卵巢動靜脈，阻斷子宮胎盤血供致胎鼠宮內窘迫，15 min后松開動脈夾，將子宮還納入腹腔并縫合。

2.2 LIP模型的構建將橡皮筋緊緊地套扎在母鼠右側腹股溝阻斷右后肢血流(脈搏氧飽和度監測)，阻斷/開放各5 min，循環3次進行母體LIP。

2.3實驗分組取40只孕鼠按隨機數字表法分成4組，每組10只。假手術(sham，S)組僅暴露子宮和卵巢的動靜脈但不阻斷; LIP組于母鼠右后肢實施LIP，其余同S組; FD組阻斷子宮和卵巢的動靜脈15 min后松開; LIP+ FD組阻斷通向子宮和卵巢動靜脈的同時行母鼠右后肢LIP。

3主要方法

3.1取材及標本處理取材對象為胎鼠。實驗后24 h剖宮取胎鼠，每只孕鼠隨機取活胎鼠6只，快速斷頭取腦，并在冰面上剝離海馬。

3.2電鏡觀察海馬CA1區神經元線粒體超微結構

海馬CA1區取1 mm×1 mm×1 mm的組織3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，乙醇-丙酮脫水，環氧樹脂618包埋劑包埋;超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，飛利浦208型透射電鏡觀察、攝影。

3.3利用JC-1熒光染色-流式細胞術檢測法檢測海馬線粒體膜電位試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所，參照試劑盒說明操作，檢測JC-1單體時把激發光設置為490 nm，發射光設置為530 nm;檢測JC-1聚合物時，把激發光設置為525 nm，發射光設置為590 nm。

3.4流式細胞術檢測海馬組織活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的含量試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所，參照試劑盒說明操作，流式細胞儀檢測參數設置:激發光波長為488 nm，發射光波長為525 nm。

3.5海馬組織錳-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量的測定黃嘌呤氧化酶法測定Mn-SOD活性，用硫代巴比妥酸法檢測MDA濃度，定磷法檢測海馬組織ATP含量變化，3種試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定步驟完全按照試劑盒說明書。

4統計學處理

應用SPSS 17.0統計學軟件進行分析處理。各組數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間數據的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

1海馬線粒體超微結構電鏡觀察結果

S組和LIP組可見核周線粒體豐富，形態基本正常，膜基本完整，結構清晰可辨，嵴密集，分布有序; FD組線粒體明顯腫脹，結構模糊，嵴變短、嵴間隙增寬，排列紊亂，部分線粒體膜破碎，嵴完全消失，空泡形成; FD+ LIP組可見線粒體輕度腫脹，基質電子密度降低，嵴排列尚可，線粒體損傷較FD組明顯減輕，見圖1。

Figure 1.The ultrastructure of mitochondria in CA1 area of the fetal hippocampus under transmission electron microscope (×16 000).圖1透射電鏡觀察各組胎鼠海馬CA1區線粒體的超微結構

2母體LIP對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬線粒體膜電位影響

與S組相比較，FD組和LIP+ FD組線粒體膜電位顯著降低(P＜0.05) ;而與FD組相比較，LIP+ FD組線粒體膜電位降低程度減輕(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of maternal LIP on mitochondrial membrane potential of fetal hippocampal neurons determined by flow cytometry with JC-1 fluorescent probe.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs FD group.圖2母體LIP對胎鼠海馬線粒體膜電位的影響

3母體LIP對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬ROS、MDA和ATP含量以及Mn-SOD活性的影響

與S組比較，LIP組胎鼠海馬ROS含量、MDA含量、ATP含量及Mn-SOD活性無明顯變化(P＞0.05) ;與S組比較，FD組和LIP+ FD組胎鼠海馬ROS含量、MDA含量增加，ATP含量減少，Mn-SOD活性降低(P＜0.05) ;與FD組比較，LIP+ FD組胎鼠海馬ROS含量、MDA含量明顯降低，ATP含量及Mn-SOD活性顯著增高(P＜0.05)，見圖3、表1。

討論

線粒體是細胞進行生物氧化和能量轉換的主要場所，是細胞內最為關鍵的細胞器之一。為此，尋找有效抑制線粒體結構受損及功能障礙方法成為腦缺血/再灌注損傷治療中最為關鍵的目標。線粒體的正常形態、結構的維持需要足夠的ATP，腦缺血過程，能量供應急劇減少，導致線粒體膜電位降低，同時線粒體通透性轉換孔道開放，Na+、Ca2+和水分進入細胞增多，致線粒體腫脹、嵴斷裂、消失等亞細胞結構的破壞;線粒體界膜可因高度腫脹而破裂，位于線粒體膜間隙的凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)、細胞色素C(cytochrome C，CytC)等釋放至胞質或轉位到胞核，激活caspase-3，導致細胞凋亡。細胞凋亡過程中，在細胞結構改變出現前，線粒體膜電位已經開始下降，線粒體膜電位是評價線粒體功能的重要指標［3］。實驗結果顯示母體LIP改善胎鼠腦缺血/再灌注損傷的能量代謝，抑制線粒體膜電位下降，保持胎鼠海馬線粒體超微結構完整性，提高腦對缺血缺氧耐受力。

Figure 3.The changes of ROS fluorescence intensity in the fetal hippocampal tissues.圖3各組胎鼠海馬組織的ROS熒光強度

表1　各組胎鼠海馬組織ROS含量、MDA含量、ATP含量及Mn-SOD活性Table 1.The effects of limb ischemic preconditioning on the levels of ROS，MDA，ATP and Mn-SOD in the fetal hippocampal tissues (Mean±SD.n=10)

缺血/再灌注后導致線粒體損傷的關鍵是氧化應激損傷［4］，主要表現為大量自由基生成，脂質過氧化產物(如MDA)增加，而機體抗氧化能力降低。有研究［5］表明LIP可減少再灌注期間自由基的生成，提高機體的抗氧化能力。腦缺血/再灌注時，抑制線粒體電子傳遞導致ROS產生增加，ROS攻擊生物膜不飽和脂肪酸，引起膜脂質過氧化，脂質過氧化產物可引起多種酶類失活、DNA變形，破壞電子傳遞鏈、阻礙氧化磷酸化、增強溶酶體通透性、破壞正常的組織結構。線粒體內膜最靠近ROS產生位點，也成為最易被ROS攻擊對象。然而機體形成了自身的抗氧化防御體系，其中Mn-SOD是機體重要氧自由基清除劑，主要存在于線粒體的基質中，是線粒體清除氧自由基的第一道防線。我們的實驗發現經過母體LIP胎鼠海馬組織中的ROS含量、MDA含量降低，Mn-SOD活性提高，提示LIP能夠直接通過提高線粒體對ROS的清除力、減少膜的脂質過氧化損傷，對腦缺血/再灌注損傷發揮保護作用。

本課題組前期研究［6］已經證實母體LIP可減輕宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元的凋亡。本研究從海馬線粒體形態學及相關功能方面觀察，表明母體LIP產生的機體內源性保護作用可以通過胎盤屏障對宮內窘迫胎鼠復氧后起腦保護作用，為減輕宮內窘迫胎兒中樞神經系統缺氧/復氧損傷提供新思路，其機制可能與抑制線粒體氧化應激損傷有關。母體LIP產生的內源性保護因子是通過何種轉導通路透過胎盤屏障對胎鼠腦起保護作用將在后續研究中深入探討。

［參考文獻］

［1］Leone TA，Finer NN.Shock: a common consequence of neonatal asphyxia［J］.J Pediatr，2011，158(2 Suppl) : e9-e12.

［2］Hess DC，Hoda MN，Bhatia K.Remote limb preconditioning and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke?［J］.Stroke，2013，44 (4) :1191-1197.

［3］DuchenMR.Roles of mitochondria in health and disease ［J］.Diabetes，2004，53(Suppl 1) : S96-S102.

［4］Guillot M，Charles AL，Chamaraux-Tran TN，et al.Oxidative stress precedes skeletal muscle mitochondrial dysfunction during experimental aortic cross-clamping but is not associated with early lung，heart，brain，liver，or kidney mitochondrial impairment［J］.J Vasc Surg，2014，60 (4) :1043-1051.e5

［5］Pei H，Wu Y，Wei Y，et al.Remote ischemic preconditioning reduces perioperative cardiac and renal events in patients undergoing elective coronary intervention: a metaanalysis of 11 randomized trials［J］.PLoS One，2014，9 (12) : e115500.

［6］吳希珠，鄭曉春，陳小琳，等.母體肢體缺血預處理對宮內窘迫胎鼠復氧后海馬神經元凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2014，30(4) :729-732，750.

通訊作者△Tel: 0591-88216136; E-mail: zhengxc2@163.com

*［基金項目］福建省自然科學基金資助項目(No.2013J01116) ;福建省衛生廳青年研究基金資助項目(No.2013-2-2)

［收稿日期］2015-02-04

［文章編號］1000-4718(2015)06-1120-05

［中圖分類號］R364.4; R363.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.027