維生素C提高體外培養的去分化脂肪細胞心肌分化效率*

李福海，李宗莊，蔣　智，易　韋，張陳勻△(貴州省心血管病研究所，貴州省人民醫院心內科，病理科，貴州貴陽　55000)

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維生素C提高體外培養的去分化脂肪細胞心肌分化效率*

李福海1，2，李宗莊1，2，蔣智1，2，易韋3，張陳勻1，2△
(1貴州省心血管病研究所，貴州省人民醫院2心內科，3病理科，貴州貴陽550002)

［摘要］目的:采用維生素C處理體外培養的去分化脂肪(dedifferentiated fat，DFAT)細胞，以期進一步提高DFAT細胞的心肌分化效率。方法:用天花板貼壁培養法使大鼠成熟脂肪細胞去分化為DFAT細胞，并體外培養增殖至第3代，然后在培養基中添加維生素C或(和)乳鼠心臟細胞裂解液誘導DFAT細胞心肌分化。3周后，用倒置相差顯微鏡觀察DFAT細胞的形態變化，用real-time PCR、免疫熒光和Western blot檢測DFAT細胞的心肌特異性標志物cTnT、GATA-4及NKx2.5 mRNA和蛋白的表達。結果:大鼠脂肪細胞經天花板貼壁培養后形態轉變為成纖維細胞樣的DFAT細胞。DFAT細胞在普通培養條件下可自發表達少量心肌特異性標志物。經乳鼠心臟細胞裂解液誘導后，DFAT細胞體積增大、變長，可見肌管樣結構，cTnT、GATA-4及NKx2.5 mRNA和蛋白的表達水平較普通培養的DFAT細胞顯著升高。在維生素C的作用下，DFAT細胞cTnT、GATA-4及NKx2.5的表達水平進一步升高。未觀察到自發性搏動細胞。結論:維生素C可促進DFAT細胞分化為心肌樣細胞。

［關鍵詞］去分化脂肪細胞;維生素C;乳鼠心臟細胞裂解液;誘導分化

［修回日期］2015-02-09

Vitamin C enhanced myocardial differentiation of dedifferentiated fat cells

LI Fu-hai1，2，LI Zong-zhuang1，2，JIANG Zhi1，2，YI Wei3，ZHANG Chen-yun1，2
(1Guizhou Institute for Cardiovascular Disease，2Department of Cardiology，3Department of Pathology，Guizhou Province People＇s Hospital，Guiyang 550002，China.E-mail: cyzhang5828@163.com)

［ABSTRACT］AIM: In order to observe the myocardial differentiation capacity of the dedifferentiated fat (DFAT) cells treated with vitamin C in vitro.METHODS: DFAT cells were dedifferentiated from the mature rat adipocytes with ceiling adherent culture.The DFAT cells of passage 3 were used in the study.Vitamin C and/or neonatal rat heart tissue lysate were added into the culture medium to induce myocardial differentiation for 3 weeks.The cell morphology was observed under microscope.The myocardial-specific markers，such as cTnT，GATA-4 and NKx2.5，were examined by the methods of immunofluorescence，PCR and Western blot.RESULTS: Mature rat adipocytes dedifferentiated into fibroblastlike DFAT cells after ceiling adherent culture.The DFAT cells spontaneously differentiated into cardiomyocyte-like cells under normal culture condition with a low incidence.After treated with neonatal rat heart cell lysate，the DFAT cells became cardiomyocyte-like cells that had bigger size，longer shape and myotubule-structure.The expression of cTnT，GATA-4 and NKx2.5 was remarkably increased at both mRNA and protein levels as compared with the normal cultured DFAT cells.The expression of cTnT，GATA-4 and NKx2.5 was further increased in DFAT cells after treating with vitamin C.No spontaneous beating cell was observed.CONCLUSION: Vitamin C enhances the differentiation of DFAT cells into cardiomyocyte-like cells.

［KEY WORDS］Dedifferentiated fat cells; Vitamin C; Neonatal rat heart cell lysate; Induced differentiation

急性心肌梗死已成為嚴重危害我國人民生命健康的重要疾病［1］。雖然藥物及介入治療有了長足進展［2］，但這些方法不能再生心肌以代償損失心肌的收縮力，限制了心功能的恢復。因此，心肌梗死患者最終難以避免的發展為充血性心力衰竭。干細胞可以分化為其它成熟細胞，如心肌細胞、內皮細胞、神經細胞等［3-5］。近年來研究發現干細胞移植到心臟梗死區可分化為心肌細胞以代償心肌收縮力，改善心梗后心功能［6-8］，為心肌梗死的治療提供了新思路。胚胎干細胞、骨骼成肌細胞、誘導多能干細胞、間充質干細胞等種子細胞已經有廣泛研究，但因來源有限、取材不便、免疫排斥、分化方向難以調控、心肌分化效率低、腫瘤形成等問題，使這些種子細胞難以廣泛應用于臨床，并且臨床療效不明確［9］。最近Matsumoto等［10］報道成熟脂肪細胞經天花板培養去分化后轉變為具有多向分化潛能的去分化脂肪(dedifferentiated fat，DFAT)細胞。DFAT細胞具有取材方便、增殖能力強［11］、免疫原性低［10］、表型穩定［10］等特點，其在體外可分化為具有收縮功能的心肌細胞［12］，是自體移植的理想種子細胞，可避免上述干細胞所面臨的重重困難。如何提高細胞的心肌分化效率是今后細胞臨床應用的重要問題之一。Behfar等［13］研究發現骨髓間充質干細胞心肌分化能力越強，移植治療心肌梗死小鼠的療效越好，維生素C可誘導胚胎干細胞［14］、誘導多能干細胞［15-16］、羊水干細胞［17］向心肌分化，但對DFAT細胞的作用尚無研究。通過本實驗，我們首次報道在乳鼠心臟細胞裂解液(neonatal rat heart cell lysate，NRHCL)體外模擬心肌微環境的誘導條件下，維生素C對細胞心肌分化效率的作用。

材料和方法

1實驗動物

4～6周齡的雄性Sprague Dawley (SD)大鼠及出生24 h內的SD乳鼠，由貴陽醫學院實驗動物中心提供，清潔級標準。

2實驗方法與步驟

2.1成熟脂肪細胞的分離及去分化培養4～6周齡SD大鼠予腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)誘導麻醉，在無菌條件下取出腹股溝處皮下脂肪組織，剪碎后加0.1% I型膠原酶(Sigma)，在37℃恒溫水浴箱振蕩消化45 min，加含20%胎牛血清(HyClone)的高糖DMEM(HyClone)終止消化，細胞濾篩過濾，將濾液1 000 r/min離心5 min。收集懸浮于最上層的成熟脂肪細胞接種于25 cm2培養瓶，用完全培養基(含20%胎牛血清的高糖DMEM)充滿培養瓶，將培養瓶翻轉倒置于細胞培養箱中進行天花板培養(37℃、5% CO2、飽和濕度)。用倒置顯微鏡下動態觀察細胞形態變化。7 d后可見脂肪細胞牢固貼于培養瓶底，翻正培養瓶，棄去培養液，每2天更換4 mL培養基繼續培養。當細胞吐出脂滴由圓形變為長梭形說明脂肪細胞已去分化為DFAT細胞。當生長融合達70%～80%時，可傳代培養，取第3～6代細胞進行后續實驗。

2.2乳鼠心臟細胞裂解液的制備將出生24 h內的SD乳鼠斷頸處死，迅速取出心臟，放入預先置于冰上的PBS液中去除心房、血管及結締組織，用PBS液清洗3次后，將心室肌充分剪碎，加入含0.1%胰酶和0.1%I型膠原酶的消化液，在37℃培養箱振蕩消化，吸管吹打、靜置后，吸取上層細胞懸液加入完全培養基中吹打混勻。如此重復消化5～6次直至組織塊消化完全。將收集的細胞懸液以1 000 r/min離心10 min，棄上清，用完全培養基重懸為2×109/L，于－70℃、4℃反復凍融3次獲得心臟細胞裂解液，最后以3 000 r/min離心10分鐘，用0.22 μm的濾器過濾后備用。

2.3體外誘導DFAT細胞向心肌細胞方向分化3 ～6代DFAT細胞制成5×108/L單細胞懸液接種于6孔板，待48 h細胞完全貼壁后，將完全培養基分別換為NRHCL、含10－4mol/L維生素C(Sigma)的完全培養基或含10－4mol/L的維生素C的NRHCL誘導心肌分化，每天換液1次，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態的變化并拍照。

2.4誘導后DFAT細胞的免疫熒光檢測取上述誘導心肌分化3周后的DFAT細胞制成細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100透膜20 min，10%封閉血清封閉30 min，用1∶200小鼠抗大鼠心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT; Santa Cruz)，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，用1∶100 FITC標記羊抗小鼠IgG(博士德公司) 37℃避光孵育1 h，抗淬滅劑封片，用熒光顯微鏡觀察并采集圖像，每個爬片隨機選取5個高倍視野拍攝照片，計數視野內cTnT陽性細胞數和總細胞數，計算cTnT陽性細胞百分比。

2.5 Real-time PCR檢測誘導后DFAT細胞心肌特異性標記物NKx2.5、GATA-4和cTnT的mRNA表達

采用RNA提取試劑盒(康為世紀)提取誘導3周后上述4組細胞的總RNA，將mRNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行real-time PCR，PCR條件為: 50℃2 min，95℃10 min;95℃15 s、60℃1 min行40個循環。ABI Step One Plus型熒光定量PCR儀采集待測基因及內參照β-actin擴增各循環熒光信號，以Applied Biosystems SDS 1.4軟件進行熒光收集和資料分析。SDS 1.4軟件分析其ΔΔCt值及熒光相對值(relative quantity，RQ)值，RQ=2－ΔΔCt。分析實驗結果時以β-actin為內參照，計算目的基因的相對表達水平。

2.6誘導后DFAT細胞心肌特異性蛋白表達水平的Western blot檢測提取試劑盒(上海生工)提取誘導3周后的上述4組細胞的總蛋白，BCA法行蛋白定量后，上樣、SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉膜轉移蛋白條帶至PVDF膜上，封閉液室溫封閉PVDF膜1 h，加I抗(1∶500)和II抗(1∶2 000)孵育后曝光、顯影、定影。用掃描儀掃描曝光膠片，用Bandscan軟件分析條帶像素灰度值。以β-actin蛋白條帶作為內參照，計算各組待測目標蛋白條帶與β-actin蛋白條帶總灰度的百分比值作為待測目標蛋白表達的相對水平。

3統計學處理

以上各部分實驗均重復4次，數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0統計軟件對數據行單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1成熟脂肪細胞去分化為DFAT細胞

培養2 d后，成熟大鼠脂肪細胞內含折光性高的單個圓形脂滴，漂浮于培養瓶頂壁，3～4 d后可見胞質中的單個圓形脂滴分裂成多個小脂滴，胞質向周圍伸展，細胞由圓形變成橢圓形，胞質外可見細小的脂滴顆粒聚集，細胞突起延長，形成類似觸角樣結構。脂滴繼續裂解變小，5～6 d后可見細胞逐漸脫去脂滴，形態變為不含脂滴或僅含少量脂滴的長梭形，并可觀察到細胞分裂增殖。10 d后細胞已完全脫去脂滴，生長融合，去分化為成纖維樣的DFAT細胞。細胞增殖第3～6代后細胞形態無明顯變化，見圖1。

Figure 1.The morphological transformation of the mature rat adipocytes to DFAT cells during ceiling adherent culture.圖1大鼠脂肪細胞經天花板培養去分化為DFAT細胞的形態變化

2 DFAT細胞經誘導分化后的形態變化

誘導1周后，細胞胞體伸展，呈長梭形，體積增大、形態變長。誘導2周后細胞生長旺盛，增殖明顯，細胞排列多趨于一致、平行生長，多數細胞伸出分支狀突起，并相互連接，呈聚集生長，上述現象在含維生素C的NRHCL組比單獨維生素C和NRHCL組更明顯。誘導3周后胞體更加飽滿，立體感增強，細胞間相互連接增多形成細胞簇，可觀察到肌管樣結構，細胞形態近似于心肌，但均未觀察到有發跳動的細胞，見圖2。

3誘導3周后DFAT細胞的cTnT免疫熒光檢測

細胞免疫熒光檢測顯示:誘導3周后，維生素C組、NRHCL組和含維生素C的NRHCL組均可觀察到心肌特異性標志物cTnT陽性細胞;這些細胞輪廓清楚，cTnT定位于細胞質，經FITC標記后在熒光顯微鏡下顯示為綠色熒光。對照組僅見非特異性著色，見圖3。

Figure 2.The morphological transformation of the DFAT cells after inducing myocardial differentiation(×300).圖2 DFAT細胞經誘導分化后的形態變化

Figure 3.The cTnT expression (green) in DFAT cells after 3weeks of inducing myocardial differentiation (×200).圖3誘導3周后DFAT細胞cTnT的表達

4誘導3周后DFAT細胞中心肌特異性標志物的表達

4.1誘導3周后DFAT細胞中cTnT mRNA和蛋白質的表達水平與對照組相比，經誘導處理3周后維生素C組和NRHCL組和含維生素C的NRHCL組細胞中cTnT mRNA和蛋白表達水平均升高(P＜0.05)，且含維生素C的NRHCL組細胞中cTnT mRNA和蛋白表達水平均高于維生素C組和NRHCL組(P＜0.05)。NRHCL組cTnT mRNA表達水平高于維生素C組(P＜0.05)，但維生素C組、NRHCL組間cTnT蛋白表達水平的差異無統計學意義，見圖4。

4.2誘導3周后DFAT細胞中GATA-4的mRNA和蛋白質表達水平與對照組相比，維生素C組、NRHCL組和含維生素C的NRHCL組細胞中GATA-4 mRNA和蛋白表達水平均升高(P＜0.05)，含維生素C的NRHCL組中GATA-4 mRNA和蛋白的表達水平均高于維生素C組和NRHCL組(P＜0.05)。且NRHCL組GATA-4的mRNA和蛋白表達水平均高于維生素C組(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.The expression of cTnT in DFAT cells after 3 weeks of induced myocardial differentiation.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vitamin C group;△P＜0.05 vs NRHCL group.圖4誘導3周后DFAT細胞中cTnT mRNA和蛋白質相對表達水平

Figure 5.The expression of GATA-4 in the DFAT cells after 3 weeks of inducing myocardial differentiation.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vitamin C group;△P＜0.05 vs NRHCL group.圖5誘導3周后DFAT細胞中GATA-4的mRNA和蛋白質相對表達水平

4.3誘導3周后DFAT細胞中NKx2.5 mRNA和蛋白質的表達水平與對照組相比，維生素C組、NRHCL組和含維生素C的NRHCL組細胞中NKx2.5 mRNA和蛋白的表達水平均升高(P＜ 0.05)，含維生素C的NRHCL組中NKx2.5 mRNA和蛋白的表達水平均高于維生素C組和NRHCL組(P＜0.05)。維生素C組、NRHCL組間NKx2.5 mRNA和蛋白的表達水平的差異均無統計學意義，見圖6。

Figure 6.The expression of NKx 2.5 in the DFAT cells after 3 weeks of inducing myocardial differentiation.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs vitamin C group;△P＜0.05 vs NRHCL group.圖6誘導3周后DFAT細胞中NKx2.5的mRNA和蛋白質相對表達水平

討論

我們分離并培養大鼠成熟脂肪細胞，用天花板貼壁培養法使其去分化為DFAT細胞，通過心臟細胞裂解液模擬心肌微環境DFAT細胞可再分化為心肌樣細胞，表達cTnT、GATA-4和NKx2.5心肌細胞特異標志，并且維生素C可進一步促進DFAT細胞的心肌分化。

DFAT細胞缺乏特異性標志物，其鑒定基于培養初期脂肪細胞的形態學變化及后期心肌特異性標志物的檢測［10，12，18］。我們參照Sugihara等［19］的天花板貼壁培養法，使圓形透亮的大鼠成熟脂肪細胞去分化為類似成纖維細胞形態的DFAT細胞，在維生素C或(和)心臟細胞裂解液作用下形態進一步發生轉變，并表達心肌特異性標志物。我們的實驗結果支持Matsumoto等［10］的研究，充分說明細胞不僅可以自我增殖，還具有心肌分化潛能。

干細胞移植治療心肌梗死的臨床實驗均采用自體干細胞移植策略［20］，其中骨髓間充質干細胞已經被廣泛研究［21-22］。骨髓成分復雜，間充質干細胞僅占所有骨髓細胞的0.01%［23］，為獲取足量骨髓常需多點骨髓穿刺，創傷較大，且骨髓間充質干細胞增殖能力較弱，擴增時間較長，體外心肌分化效率不高。相比之下，細胞具有的特殊優勢一是來源豐富，100 mg的脂肪組織至少可獲得3×106個原代細胞［24］，且脂肪組織經微創抽脂技術反復取材，患者更容易接受;二是細胞純度高，原代細胞的純度高達99.9%［12］，體外培養時即呈現較強的心肌分化能力［25］。三是對供者年齡要求較低，據報道4～81歲供者的成熟脂肪細胞均可在體外培養中去分化為細胞［24］。根據細胞上述優勢，可預先在體外定向分化為心肌前體細胞或心肌細胞，再移植修復梗死心肌，可有效克服骨髓間充質干細胞存在的問題。

干細胞的心肌分化由BMP、Wnt、Ras-Raf-MPAK、FGF等信號通路共同形成的復雜的三維多重生物網絡系統所調控［26］。乳鼠心臟細胞裂解液可以體外模擬心肌生長微環境［27-28］，最大限度地重現了心肌定向分化生長的生物調控網絡環境，促使細胞心肌分化，但究竟是哪些成分有效目前尚無相關報道。心臟細胞裂解液的制備需反復凍融，我們推測可能是其中比較穩定的小分子物質，如microRNA。但microRNA家族龐大，調控機制復雜，我們尚未進行該方向的研究。

除心臟細胞裂解液外，誘導干細胞心肌分化的方法還有用化學試劑、細胞因子誘導、物理因素誘導、用基因工程技術干擾基因表達等。其中化學試劑如5-氮胞苷、DMSO等誘導效率低，且有細胞毒性，同樣對人體有害，限制了臨床應用;而細胞因子常需多種細胞因子組合多個時點聯合誘導［29］，且價格過于昂貴;物理因素誘導分化雖然效果確切，但設備技術要求高;基因工程技術存在潛在生物安全問題。維生素C是Takahashi等［14］從可應用于人體且具有誘導胚胎干細胞分化為心肌細胞的880種分化誘導化合物中篩選而出，經大量實驗研究證實可誘導胚胎干細胞［14］、誘導多能干細胞［15-16］、羊水干細胞［17］分化為心肌樣細胞。我們的實驗首次證明了維生素C同樣可誘導DFAT細胞心肌分化，維生素C的應用避免了化學誘導的細胞毒性及基因工程技術潛在的生物安全隱患，同時，具有更好的經濟效益，其機制可能與維生素C激活MEK-ERK1/2信號有關［15］。

我們體外誘導心肌分化的細胞可表達心肌特異性標志物，但均未觀察到自發的收縮活動，我們稱這種轉分化的具有部分心肌細胞表型的細胞為心肌樣細胞，與Jumabay等［12］報道的有自發收縮的類心肌細胞不完全一致。我們推測心肌樣細胞的心肌分化程度較低，與細胞種屬來源、培養誘導分化條件等有關。

我們在國內率先分離培養出DFAT細胞，盡管分化程度不高，但首次證明了維生素C可誘導細胞心肌分化，并且在心臟細胞裂解液體外模擬心肌微環境的條件下，可進一步提高細胞的心肌分化效率。細胞來源廣泛、細胞純度高、增殖能力強、體外心肌分化效率高，是心肌再生治療中理想的自體移植的種子細胞。我們的實驗研究為細胞的自體移植策略奠定理論和實踐基礎，如何進一步提高細胞的心肌分化效率和分化程度是今后細胞臨床應用的重要研究方向。

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通訊作者△Tel: 0851-5612525; E-mail: cyzhang5828@163.com

*［基金項目］貴州省科技廳科學技術基金資助項目(No.黔科合J字［2014］2112) ;貴州省衛生廳科學技術基金資助項目(No.gzwkj2013-1-006)

［收稿日期］2014-10-08

［文章編號］1000-4718(2015)06-1130-07

［中圖分類號］R329.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.029