黃菠蘿嫩莖離體培養(yǎng)再生體系的建立

王新天， 王新宇， 李曉萍， 王紅艷， 王伶俐， 郭志新， 張成婧， 韓學(xué)慧， 劉 欣

(1.雙遼市林木種苗管理站，吉林四平 136400;2.雙遼市鄭家屯街林業(yè)站，吉林四平 136400;3.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院,吉林長春 130033)

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黃菠蘿嫩莖離體培養(yǎng)再生體系的建立

王新天1， 王新宇2， 李曉萍1， 王紅艷1， 王伶俐1， 郭志新1， 張成婧1， 韓學(xué)慧1， 劉 欣3

(1.雙遼市林木種苗管理站，吉林四平 136400;2.雙遼市鄭家屯街林業(yè)站，吉林四平 136400;3.吉林省林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院,吉林長春 130033)

[目的]優(yōu)化黃菠蘿離體培養(yǎng)再生體系。[方法]以黃菠蘿帶腋芽的嫩莖為外植體，采用正交設(shè)計(jì)研究其離體培養(yǎng)再生體系。[結(jié)果] 誘導(dǎo)黃菠蘿的最佳初代培養(yǎng)基是MS+1.5 mg/L 6-BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L蔗糖，繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基組合是MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基組合是1/2MS+0.4 mg/LNAA +30 g/L蔗糖。[結(jié)論]以黃菠蘿帶腋芽的嫩莖為外植體，采用正交設(shè)計(jì)研究其離體培養(yǎng)和植株再生技術(shù)方法是可行的。

黃菠蘿；組織培養(yǎng)；再生體系；正交設(shè)計(jì)

黃菠蘿(PhellodendronamurenseRupr.)，屬蕓香科黃檗屬落葉闊葉喬木，是國家級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。目前對(duì)黃菠蘿的研究較少，一般偏重于采種[1]、育苗[2]、嫩枝扦插[3]、藥用價(jià)值[4]方面的研究。近年來，黃菠蘿資源日益減少，甚至在某些地區(qū)瀕臨滅絕。黃菠蘿組織培養(yǎng)方面已有報(bào)道,如郭勇[5]用黃菠蘿莖段誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽進(jìn)而再生植株，愈傷組織誘導(dǎo)率為82%，由于經(jīng)過愈傷組織分化階段，體細(xì)胞變異的可能性較大，在快速繁殖中一般不采用這種方式。叢生芽增殖方式是指莖尖或腋芽在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)，不斷發(fā)生腋芽，再從芽的葉腋內(nèi)長出小芽，腋芽不斷形成又不斷萌動(dòng)，形成叢生苗，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根成苗，擴(kuò)大繁殖。由于在其增殖過程中，無需經(jīng)過愈傷組織而可以再生，直接從芽到芽，是其無性系后代最能保持原品種特性的一種繁殖方式。這種增殖方式在數(shù)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)等方面都優(yōu)于其他傳統(tǒng)的繁殖方式，因此，是林木快繁中運(yùn)用最為廣泛的一種繁殖方式。建立黃菠蘿的組織培養(yǎng)體系，不僅可以迅速地獲得大量優(yōu)質(zhì)的造林苗木，還可以為以后用作生物技術(shù)和基因工程方法對(duì)植物進(jìn)行遺傳改良。為此，筆者以帶腋芽的莖段為外植體，以叢生芽增殖方式形成幼苗，采用正交設(shè)計(jì)方法研究影響黃菠蘿離體再生的主要因素，建立高效離體再生的組培體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理 黃菠蘿采自吉林省露水河林業(yè)局的天然近熟群體林，于2月份取成年樹一年生的無病蟲害枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室置于水中培養(yǎng)，取帶腋芽的莖段為外植體，將其新萌發(fā)的幼嫩枝條采下后先在流水下反復(fù)沖洗0.5～1.0 h，再用飽和中性洗衣粉液洗滌枝條，流水徹底沖洗，濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到滅菌的超凈工作臺(tái)上，用70%～75%乙醇表面消毒15 s，將外植體在0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，接種在初代培養(yǎng)基上，每瓶接種1個(gè)外植體，每處理接種30瓶。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用正交設(shè)計(jì)，不同培養(yǎng)階段各種因素水平見表1，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。在正交試驗(yàn)中,初代培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)外植體的誘導(dǎo)率，繼代培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)試管苗的高凈增量，生根培養(yǎng)統(tǒng)計(jì)試管苗的生根數(shù)。

表1 不同培養(yǎng)階段的因素水平

1.3 培養(yǎng)條件 所有培養(yǎng)基pH為 5.8，在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。培養(yǎng)溫度為(22±2) ℃,光周期為14 h/d，光照強(qiáng)度為50～70 μmol/(m2·s)。

1.4 數(shù)據(jù)處理 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，統(tǒng)計(jì)分析用SPSS完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代最佳培養(yǎng)基的篩選 由表2可知，誘導(dǎo)黃菠蘿的最佳初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.06 mg/L+蔗糖20 g/L，即最佳工藝組合是A2B3A3D2。方差分析結(jié)果表明，A、B、C、D 4個(gè)因素差異極顯著。此外，4種基本培養(yǎng)基對(duì)莖段的誘導(dǎo)能力依次為MS>1/2MS>WPM>B5，它們之間差異均達(dá)到顯著水平，且MS與其他3種達(dá)到極顯著水平。從長勢(shì)情況來看，MS培養(yǎng)基上莖段誘導(dǎo)的不定芽，葉片伸展，葉色鮮綠，節(jié)效果最好。

表2 初代培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 繼代最佳培養(yǎng)基的篩選 方差分析結(jié)果表明，6-BA各水平間差異極顯著，NAA各水平間差異顯著，IBA各水平間差異不顯著。各個(gè)因素的主次依次是A、B、C，表明在繼代培養(yǎng)中細(xì)胞分裂素起的作用最大，2種生長素NAA比IBA的效果好。由于IBA各水平差異不顯著，因此只對(duì)6-BA和NAA各水平間進(jìn)行多重比較。由表3可知，2個(gè)因素均為第二個(gè)水平效果最好，由于IBA差異不顯著，在2種生長素中只選擇NAA，繼代培養(yǎng)最佳激素組合為A2B2，即6-BA 1.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L。

2.3 生根最佳培養(yǎng)基的篩選 方差分析結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基各水平間差異極顯著，6-BA各水平間差異不顯著，NAA各水平間差異極顯著，蔗糖各水平間差異極顯著。各個(gè)因素的主次依次是A、C、D、B。由于6-BA差異不顯著，因此只對(duì)其他3個(gè)因素的各水平間進(jìn)行多重比較(表4)。由表4可知，生根培養(yǎng)的最佳組合為A1C2D3，即培養(yǎng)基為1/2MS，NAA濃度為0.4 mg/L，蔗糖濃度為30 g/L。

表3 繼代培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 生根培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基中含有外植體生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，是組織培養(yǎng)中外植體賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)。在初代培養(yǎng)中4種基本培養(yǎng)基對(duì)莖段誘導(dǎo)率的大小為MS>1/2MS>WPM>B5，它們之間差異均達(dá)到顯著水平，且MS與其他3種達(dá)到極顯著水平，從長勢(shì)情況來看，MS培養(yǎng)基上莖段誘導(dǎo)的不定芽，葉片伸展，葉色鮮綠，節(jié)效果最好。而在生根培養(yǎng)階段則需要低濃度的鹽，4種基本培養(yǎng)基對(duì)根誘導(dǎo)率的大小為1/2MS>MS>WPM>B5。另外在組織培養(yǎng)的各個(gè)階段，基本培養(yǎng)基都是最重要的因素，因此選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素。

該研究使用的細(xì)胞分裂素是結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定的人工合成的6-BA。研究發(fā)現(xiàn)，在初代培養(yǎng)中， 6-BA的4個(gè)水平中分出了2個(gè)等級(jí)，盡管2、3水平上差異不顯著，從方差分析的角度兩者皆可選，但考慮3水平的平均值略高于2水平，所以選擇了3水平的濃度，即6-BA選擇1.5 mg/L。而在繼代培養(yǎng)中對(duì)6-BA共設(shè)置了3個(gè)梯度，結(jié)果表明各水平間差異極顯著，其中以1.0 mg/L最好。在生根培養(yǎng)中對(duì)6-BA共設(shè)計(jì)4個(gè)梯度，結(jié)果表明，4個(gè)水平下的6-BA差異不顯著，因而在生根培養(yǎng)中6-BA的影響不大。綜合來看，在初代培養(yǎng)中需要高濃度的細(xì)胞分裂素，在繼代培養(yǎng)中6-BA的濃度有所降低，而在生根培養(yǎng)中6-BA的作用很小，甚至可以不加。

該研究所使用的生長素是NAA。研究發(fā)現(xiàn)，在初代培養(yǎng)中，4個(gè)因素中NAA的作用最小，但4個(gè)水平差異顯著，3、4水平之間差異不顯著，但只有3水平與其他2個(gè)水平差異極顯著，而4水平與其他2個(gè)水平差異則不顯著，因而選擇3水平的0.06 mg/L作為NAA的最優(yōu)濃度。在繼代培養(yǎng)中NAA的作用明顯優(yōu)于IBA，IBA的作用不顯著，與他人的結(jié)果不一致，可能是所設(shè)的濃度不理想所致。而NAA的濃度以0.1 mg/L為最佳。在生根培養(yǎng)中， NAA在4個(gè)因素中也比較重要，4個(gè)水平差異極顯著，其中以0.4 mg/L誘導(dǎo)的根數(shù)最多。綜合來看，在這3個(gè)培養(yǎng)階段，NAA的濃度變化較大，且濃度逐漸升高。

糖是培養(yǎng)基中不可缺少的碳源，該試驗(yàn)選用的糖源是蔗糖，在不同培養(yǎng)階段用量也不完全相同。在初代培養(yǎng)中，蔗糖含量對(duì)誘導(dǎo)率產(chǎn)生顯著和極顯著的影響，4個(gè)水平分出了2個(gè)等級(jí)，在2個(gè)較好的水平中，只有2水平下的結(jié)果與其他2個(gè)水平的結(jié)果差異極顯著，因此2水平下的20 g/L蔗糖為最佳濃度。在生根培養(yǎng)中，4個(gè)蔗糖濃度水平下的生根數(shù)差異顯著或極顯著，比較而言3水平下的蔗糖濃度最好，即30 g/L。綜合來看，在初代培養(yǎng)中蔗糖需求量不大，而在生根培養(yǎng)中則需要較高濃度的蔗糖。

正交設(shè)計(jì)是多因素分析的有力工具, 可以從許多因素中選出主要影響因素及最佳水平, 用較少的試驗(yàn)次數(shù)獲得較多的信息[6]。正交設(shè)計(jì)可以精簡(jiǎn)試驗(yàn)次數(shù)、克服在培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)上的盲目性、提高工作效率和試驗(yàn)的可靠性[7]。近年來正交設(shè)計(jì)等統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用于許多植物的離體培養(yǎng)[8-10],并取得良好的試驗(yàn)效果,但在黃菠蘿組織培養(yǎng)中尚未見該方法的報(bào)道。該試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)的方法,僅用較少的試驗(yàn)組合,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 明確了黃菠蘿初代、繼代、生根培養(yǎng)各階段的主要因素,同時(shí)優(yōu)化篩選了最佳培養(yǎng)基,簡(jiǎn)化了研究方案,加快了研究進(jìn)程。成功應(yīng)用正交設(shè)計(jì)法的關(guān)鍵是參試因子和試驗(yàn)水平范圍的正確選擇。該試驗(yàn)中大多數(shù)參試因子產(chǎn)生的效應(yīng)存在明顯差異,篩選出來的培養(yǎng)基中各因子的水平基本在試驗(yàn)水平范圍之內(nèi),能大體反映全部組合的試驗(yàn)效果,因此該試驗(yàn)對(duì)參試因子和試驗(yàn)水平范圍的選擇是較適宜的。該研究未考慮因子間的交互作用,需要在以后的研究和實(shí)踐中進(jìn)一步完善。

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Establishment for Regeneration System of Younger Stem ofPhellodendronamurenseRupr.invitro

WANG Xin-tian1, WANG Xin-yu2, LI Xiao-ping1et al

(1. Shuangliao City Forest Tree Seedlings Station, Siping, Jilin 136400; 2. Shuangliao City Zhengjiatun Forest Station, Siping, Jilin 136400)

[Objective] To optimizePhellodendronamurenseRupr.invitroculture regeneration system. [Method] By using axillary bud-bearing young stem ofPhellodendronamurenseas explants, the orthogonal experimental design was employed to study theinvitroculture and regeneration condition. [Result] The optimum primary medium was MS +1.5 mg/L 6-BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L sucrose, the best growth regulatory substance combination of medium for subculture was MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA, and the best rooting medium was 1/2MS +0.4 mg/LNAA + 30 g/L sucrose. [Conclusion] Taking axillary bud-bearing young stem ofPhellodendronamurenseas explants, adopting orthogonal design to study itsinvitroculture and plants regeneration technique is feasible.

PhellodendronamurenseRupr.; Tissue culture; Regeneration system; Orthogonal design

王新天(1978- )，男，吉林雙遼人，從事林木種苗生產(chǎn)和管理工作。

2015-04-07

S 604+.3

A

0517-6611(2015)17-310-03