黃菠蘿嫩莖離體培養再生體系的建立

王新天， 王新宇， 李曉萍， 王紅艷， 王伶俐， 郭志新， 張成婧， 韓學慧， 劉 欣

(1.雙遼市林木種苗管理站，吉林四平 136400;2.雙遼市鄭家屯街林業站，吉林四平 136400;3.吉林省林業勘察設計研究院,吉林長春 130033)

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黃菠蘿嫩莖離體培養再生體系的建立

王新天1， 王新宇2， 李曉萍1， 王紅艷1， 王伶俐1， 郭志新1， 張成婧1， 韓學慧1， 劉 欣3

(1.雙遼市林木種苗管理站，吉林四平 136400;2.雙遼市鄭家屯街林業站，吉林四平 136400;3.吉林省林業勘察設計研究院,吉林長春 130033)

[目的]優化黃菠蘿離體培養再生體系。[方法]以黃菠蘿帶腋芽的嫩莖為外植體，采用正交設計研究其離體培養再生體系。[結果] 誘導黃菠蘿的最佳初代培養基是MS+1.5 mg/L 6-BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L蔗糖，繼代培養的最佳培養基組合是MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA，最佳生根培養基組合是1/2MS+0.4 mg/LNAA +30 g/L蔗糖。[結論]以黃菠蘿帶腋芽的嫩莖為外植體，采用正交設計研究其離體培養和植株再生技術方法是可行的。

黃菠蘿；組織培養；再生體系；正交設計

黃菠蘿(PhellodendronamurenseRupr.)，屬蕓香科黃檗屬落葉闊葉喬木，是國家級重點保護植物。目前對黃菠蘿的研究較少，一般偏重于采種[1]、育苗[2]、嫩枝扦插[3]、藥用價值[4]方面的研究。近年來，黃菠蘿資源日益減少，甚至在某些地區瀕臨滅絕。黃菠蘿組織培養方面已有報道,如郭勇[5]用黃菠蘿莖段誘導愈傷組織和不定芽進而再生植株，愈傷組織誘導率為82%，由于經過愈傷組織分化階段，體細胞變異的可能性較大，在快速繁殖中一般不采用這種方式。叢生芽增殖方式是指莖尖或腋芽在適宜的培養基上誘導，不斷發生腋芽，再從芽的葉腋內長出小芽，腋芽不斷形成又不斷萌動，形成叢生苗，然后轉入生根培養基，誘導生根成苗，擴大繁殖。由于在其增殖過程中，無需經過愈傷組織而可以再生，直接從芽到芽，是其無性系后代最能保持原品種特性的一種繁殖方式。這種增殖方式在數量、質量和經濟等方面都優于其他傳統的繁殖方式，因此，是林木快繁中運用最為廣泛的一種繁殖方式。建立黃菠蘿的組織培養體系，不僅可以迅速地獲得大量優質的造林苗木，還可以為以后用作生物技術和基因工程方法對植物進行遺傳改良。為此，筆者以帶腋芽的莖段為外植體，以叢生芽增殖方式形成幼苗，采用正交設計方法研究影響黃菠蘿離體再生的主要因素，建立高效離體再生的組培體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理 黃菠蘿采自吉林省露水河林業局的天然近熟群體林，于2月份取成年樹一年生的無病蟲害枝條，帶回實驗室置于水中培養，取帶腋芽的莖段為外植體，將其新萌發的幼嫩枝條采下后先在流水下反復沖洗0.5～1.0 h，再用飽和中性洗衣粉液洗滌枝條，流水徹底沖洗，濾紙吸干表面水分，轉移到滅菌的超凈工作臺上，用70%～75%乙醇表面消毒15 s，將外植體在0.1% HgCl2溶液中消毒8 min后，接種在初代培養基上，每瓶接種1個外植體，每處理接種30瓶。

1.2 試驗設計 采用正交設計，不同培養階段各種因素水平見表1，每組試驗重復3次。在正交試驗中,初代培養統計外植體的誘導率，繼代培養統計試管苗的高凈增量，生根培養統計試管苗的生根數。

表1 不同培養階段的因素水平

1.3 培養條件 所有培養基pH為 5.8，在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。培養溫度為(22±2) ℃,光周期為14 h/d，光照強度為50～70 μmol/(m2·s)。

1.4 數據處理 對數據進行方差分析和多重比較，統計分析用SPSS完成。

2 結果與分析

2.1 初代最佳培養基的篩選 由表2可知，誘導黃菠蘿的最佳初代培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.06 mg/L+蔗糖20 g/L，即最佳工藝組合是A2B3A3D2。方差分析結果表明，A、B、C、D 4個因素差異極顯著。此外，4種基本培養基對莖段的誘導能力依次為MS>1/2MS>WPM>B5，它們之間差異均達到顯著水平，且MS與其他3種達到極顯著水平。從長勢情況來看，MS培養基上莖段誘導的不定芽，葉片伸展，葉色鮮綠，節效果最好。

表2 初代培養正交試驗結果

2.2 繼代最佳培養基的篩選 方差分析結果表明，6-BA各水平間差異極顯著，NAA各水平間差異顯著，IBA各水平間差異不顯著。各個因素的主次依次是A、B、C，表明在繼代培養中細胞分裂素起的作用最大，2種生長素NAA比IBA的效果好。由于IBA各水平差異不顯著，因此只對6-BA和NAA各水平間進行多重比較。由表3可知，2個因素均為第二個水平效果最好，由于IBA差異不顯著，在2種生長素中只選擇NAA，繼代培養最佳激素組合為A2B2，即6-BA 1.0 mg/L，NAA 0.1 mg/L。

2.3 生根最佳培養基的篩選 方差分析結果表明，基本培養基各水平間差異極顯著，6-BA各水平間差異不顯著，NAA各水平間差異極顯著，蔗糖各水平間差異極顯著。各個因素的主次依次是A、C、D、B。由于6-BA差異不顯著，因此只對其他3個因素的各水平間進行多重比較(表4)。由表4可知，生根培養的最佳組合為A1C2D3，即培養基為1/2MS，NAA濃度為0.4 mg/L，蔗糖濃度為30 g/L。

表3 繼代培養正交試驗結果

表4 生根培養正交試驗結果

3 結論與討論

培養基中含有外植體生長所需要的營養物質，是組織培養中外植體賴以生存和發展的基礎。在初代培養中4種基本培養基對莖段誘導率的大小為MS>1/2MS>WPM>B5，它們之間差異均達到顯著水平，且MS與其他3種達到極顯著水平，從長勢情況來看，MS培養基上莖段誘導的不定芽，葉片伸展，葉色鮮綠，節效果最好。而在生根培養階段則需要低濃度的鹽，4種基本培養基對根誘導率的大小為1/2MS>MS>WPM>B5。另外在組織培養的各個階段，基本培養基都是最重要的因素，因此選擇合適的培養基是組織培養成功與否的關鍵因素。

該研究使用的細胞分裂素是結構比較穩定的人工合成的6-BA。研究發現，在初代培養中， 6-BA的4個水平中分出了2個等級，盡管2、3水平上差異不顯著，從方差分析的角度兩者皆可選，但考慮3水平的平均值略高于2水平，所以選擇了3水平的濃度，即6-BA選擇1.5 mg/L。而在繼代培養中對6-BA共設置了3個梯度，結果表明各水平間差異極顯著，其中以1.0 mg/L最好。在生根培養中對6-BA共設計4個梯度，結果表明，4個水平下的6-BA差異不顯著，因而在生根培養中6-BA的影響不大。綜合來看，在初代培養中需要高濃度的細胞分裂素，在繼代培養中6-BA的濃度有所降低，而在生根培養中6-BA的作用很小，甚至可以不加。

該研究所使用的生長素是NAA。研究發現，在初代培養中，4個因素中NAA的作用最小，但4個水平差異顯著，3、4水平之間差異不顯著，但只有3水平與其他2個水平差異極顯著，而4水平與其他2個水平差異則不顯著，因而選擇3水平的0.06 mg/L作為NAA的最優濃度。在繼代培養中NAA的作用明顯優于IBA，IBA的作用不顯著，與他人的結果不一致，可能是所設的濃度不理想所致。而NAA的濃度以0.1 mg/L為最佳。在生根培養中， NAA在4個因素中也比較重要，4個水平差異極顯著，其中以0.4 mg/L誘導的根數最多。綜合來看，在這3個培養階段，NAA的濃度變化較大，且濃度逐漸升高。

糖是培養基中不可缺少的碳源，該試驗選用的糖源是蔗糖，在不同培養階段用量也不完全相同。在初代培養中，蔗糖含量對誘導率產生顯著和極顯著的影響，4個水平分出了2個等級，在2個較好的水平中，只有2水平下的結果與其他2個水平的結果差異極顯著，因此2水平下的20 g/L蔗糖為最佳濃度。在生根培養中，4個蔗糖濃度水平下的生根數差異顯著或極顯著，比較而言3水平下的蔗糖濃度最好，即30 g/L。綜合來看，在初代培養中蔗糖需求量不大，而在生根培養中則需要較高濃度的蔗糖。

正交設計是多因素分析的有力工具, 可以從許多因素中選出主要影響因素及最佳水平, 用較少的試驗次數獲得較多的信息[6]。正交設計可以精簡試驗次數、克服在培養基配方設計上的盲目性、提高工作效率和試驗的可靠性[7]。近年來正交設計等統計方法應用于許多植物的離體培養[8-10],并取得良好的試驗效果,但在黃菠蘿組織培養中尚未見該方法的報道。該試驗采用正交設計的方法,僅用較少的試驗組合,通過統計學分析, 明確了黃菠蘿初代、繼代、生根培養各階段的主要因素,同時優化篩選了最佳培養基,簡化了研究方案,加快了研究進程。成功應用正交設計法的關鍵是參試因子和試驗水平范圍的正確選擇。該試驗中大多數參試因子產生的效應存在明顯差異,篩選出來的培養基中各因子的水平基本在試驗水平范圍之內,能大體反映全部組合的試驗效果,因此該試驗對參試因子和試驗水平范圍的選擇是較適宜的。該研究未考慮因子間的交互作用,需要在以后的研究和實踐中進一步完善。

[1] 張泉,朱成仁.黃菠蘿采種及育苗技術的研究[J].林業勘察設計,2005(3)：44-47.

[2] 龍作義,苑國，周敬偉.溫室效應對塑料大棚黃菠蘿育苗的影響[J].牡丹江師范學院學報,2005(2)：17-20.

[3] 于樹成,張淑華，閆紅霞，等.黑龍江省主要闊葉樹種綠枝扦插效果初步分析[J].林業勘察設計,2003(1)：25-28.

[4] 李霞,閻秀峰,劉劍鋒.氮素形態對黃檗幼苗三種生物堿含量的影響[J].生態學報,2005，25(9):2159-2164.

[5] 郭勇,石大興,孫雁霞,等.黃檗的組織培養和快速繁殖[J].植物生理學通訊,2005，41(6):792.

[6] 李春喜,姜麗娜,邵云,等.生物統計學[M].北京：科學出版社，2005：177-183.

[7] 王建華,王義, 孫國偉, 等.人參組織培養的多因子正交試驗研究[J].吉林農業大學學報,2006，28(6):648-651.

[8] 張菊紅,謝妤,汪承剛,等.正交設計在歐洲菘藍組織培養中的應用[J].湖北大學學報，2006，28(2)：183-186.

[9] 宋莉英,譚諍,高峰.苦瓜愈傷組織誘導的多因子正交試驗研究[J]. 西南師范大學學報,2004，29(3):462-465.

[10] 李成慧,蔡斌,單麗麗,等.應用正交設計法探討蝴蝶蘭葉片類原球莖的誘導[J].揚州大學學報,2004，25(2):76-78.

Establishment for Regeneration System of Younger Stem ofPhellodendronamurenseRupr.invitro

WANG Xin-tian1, WANG Xin-yu2, LI Xiao-ping1et al

(1. Shuangliao City Forest Tree Seedlings Station, Siping, Jilin 136400; 2. Shuangliao City Zhengjiatun Forest Station, Siping, Jilin 136400)

[Objective] To optimizePhellodendronamurenseRupr.invitroculture regeneration system. [Method] By using axillary bud-bearing young stem ofPhellodendronamurenseas explants, the orthogonal experimental design was employed to study theinvitroculture and regeneration condition. [Result] The optimum primary medium was MS +1.5 mg/L 6-BA +0.06 mg/L NAA +20 g/L sucrose, the best growth regulatory substance combination of medium for subculture was MS+1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA, and the best rooting medium was 1/2MS +0.4 mg/LNAA + 30 g/L sucrose. [Conclusion] Taking axillary bud-bearing young stem ofPhellodendronamurenseas explants, adopting orthogonal design to study itsinvitroculture and plants regeneration technique is feasible.

PhellodendronamurenseRupr.; Tissue culture; Regeneration system; Orthogonal design

王新天(1978- )，男，吉林雙遼人，從事林木種苗生產和管理工作。

2015-04-07

S 604+.3

A

0517-6611(2015)17-310-03