新疆地方特色馕面團優良酵母菌的篩選

瑪依古麗·庫爾班，米爾班古麗·阿卜杜如蘇力，麥合甫再木·阿不都熱合曼，艾爾肯·熱合曼

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830046)

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新疆地方特色馕面團優良酵母菌的篩選

瑪依古麗·庫爾班，米爾班古麗·阿卜杜如蘇力，麥合甫再木·阿不都熱合曼，艾爾肯·熱合曼*

(新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊 830046)

[目的] 篩選馕面團優質酵母菌。[方法] 從新疆烏魯木齊、阿爾泰，喀什3個樣品點采集樣品，采用PDA和YEPD培養基分離純化了馕面團發酵酵母菌，并進行了26S rDNA D1/D2 區域序列測定和系統發育分析。[結果] 試驗得出，29株菌相互之間的26S rDNA D1/D2基因序列同源性比例為99%。在這29株菌26S rDNA D1/D2區序列的基礎上采用鄰近法構建了系統發育進化樹，從中選出了11株代表菌，它們被認為是該地區特殊而獨特的酵母品系，完成了初篩。進一步測定11株菌的發酵活力、發酵前后的pH與面團醒發時間，完成了復篩并獲得了6株菌。接著對6株酵母菌進行了感官測試，最后獲得了一株優質酵母菌K24(KM454437)，馕感官評分為 97.1 分。[結論]研究篩選出來的一株馕面團酵母菌發酵效率高，為新疆馕加工產業提供技術依據。

馕面團；酵母菌；26S rDNA D1/D2 區域；篩選

新疆獨特的地理與氣候環境[1]決定了以馕為中心的獨特的飲食文化。 馕是以小麥面、玉米面或高梁面為原料，加少許鹽水和酵面烤制而成的一種面餅，是維吾爾族的傳統主食之一[2]。近年來隨著我國經濟的發展，人民生活水平的不斷提高和生活節奏的加快，城鎮居民對馕商品的需求量急劇增加，同時對馕的質量也提出了更高的要求，馕的工業化生產已成為現代社會的需求。在馕的制造過程中，馕面團發酵是一個很重要的環節，馕面團發酵最關鍵的是酵母菌，它與成品的質量有著密切的關系。當前制馕中馕面團發酵大都采用自然發酵或者直接采用外購普通的酵母粉，而熟知制馕工藝或者喜愛馕的人都明白酵母對于馕的口感和風味都具有重要的作用。很多新疆人都非常愛吃用傳統的馕面團發酵的馕。馕面團又稱老酵、酵頭、老肥、面種、面頭[3]，發酵是我國的傳統面團發酵方法，在新疆廣大城鄉居民家庭中至今仍被廣泛應用。這種方法成本低廉，簡便易行，并且可使馕保持原汁原味。但是馕面團中大量雜菌的存在，不但具有傳播病源的風險，還會導致面團發酵過酸，需要添加蘇打進行中和酸味。目前常見的各種廠家生產的商品酵母粉產品雖然馳名國內外，但尚未見到能被新疆原居民廣泛采用和在口感上認可的馕面團發酵酵母粉；這主要可能是馕發酵酵母是該地區保存的特殊酵母品系，它們與酵母粉制品中的酵母是不同的酵母品種或品系，因而產生的代謝產物有差異；酵母粉發酵馕餅面團導致馕餅口感變味，降低了馕餅應有的食用價值和觀賞性。在我國目前對酵母菌資源的開發利用中，李自紅從民間采集的饅頭老酵頭中分離酵母菌 25 株，篩選出制作饅頭的優良酵母菌被鑒定為釀酒酵母[4]。李寶坤等從自然發酵的 5 種哈密瓜汁中分離得到 25 株酵母菌并從中篩選得到1株產酒精能力高的釀酒酵母[5]。但目前為止，國內外研究中還沒發現與新疆馕面團優質酵母篩選有關的研究。采用現代微生物技術，從新疆傳統的馕面團中篩選出優良的發酵酵母菌，確保馕制品的原有風味，為提高馕加工品質提供技術依據，是實現馕工業化烤制進程的必要途徑，也是一個新產業發展的增長點，具有極大的社會經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌株。2014年3月份從南北疆的3個地點采集樣品，采樣位點分別是：烏魯木齊、阿爾泰、喀什。將馕面團樣品放入滅菌的容器里，置于4 ℃冰箱內保存備用。

1.1.2 主要儀器。量筒(1 000 ml)；和面機(2 kg)；環保電子馕坑；PCR 擴增儀，Biometra；PHB-8型筆式 pH 計，上海虹益儀器儀表有限公司；SW-CJ-IF 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；HZQ-2全溫振蕩器，金壇市醫療儀器廠；冷凍離心機，Thermo LEGEND MICRO 17R；凝膠成像分析儀 ALPHAIMAGERTM 2200，AlphaInnotech 公司；數控恒溫水浴鍋，寧波東勝儀器公司；DYY-III-3A水平電泳槽，北京六一儀器廠。1.1.3 主要原料試劑。小麥粉、土豆，從市場購買；酵母浸粉、蛋白胨、 瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉、 硝酸鉀、 硝酸銨、 尿素、 可溶性淀粉，天津市福晨化學試劑廠；蔗糖、 葡萄糖，天津市化學試劑三廠；均為國產分析純。Taq酶、10×TaqBuffer、DNA聚合酶，dNTP Mixture，北京天根生化科技有限公司；通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-GG-3′)[6]引物對，上海生工生物工程有限公司合成。1.1.4 培養基。馬鈴薯培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，鏈霉素20 mg，瓊脂粉20 g，水1 000 ml(pH自然，121 ℃ 20 min)。YEPD培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，瓊脂粉20 g，水1 000 ml(pH自然，115 ℃，20 min)。

1.2 方法

1.2.1 試驗方案。馕面團優質酵母菌篩選工藝流程見圖1。

圖1 新疆地方特色馕面團優質酵母菌的篩選工藝流程

1.2.2 目標酵母菌的分離與純化。采用梯度稀釋涂布平板法進行分離，稱取馕面團樣品10 g，溶解于90 ml含有玻璃珠的滅菌生理鹽水中，振蕩30 min。分別取10-1～10-5共5個梯度濃度，每皿100 μl，涂布分離。28 ℃培養48～120 h，挑取不同形態單菌落，編號，經多次劃線純化，獲得純培養物[7]。

1.2.3 菌落形態細胞形態的觀察。YEPD固體培養基上28 ℃培養48～72 h，觀察其菌落形態、邊緣、大小、顏色、表面及質地、側面、透明度等特征。酵母細胞形態觀察采用堿性伊紅美藍染色法[8]。將待測菌株置于28 ℃，培養2 d后挑選單個菌落進行鏡檢并記錄細胞的微觀形態(大小、形狀等)特征。1.2.4 菌株基因組DNA的提取、PCR 擴增和序列測定。菌株DNA的提取采用CTAB法[9-11]。用引物NL1和NL4擴增所分離菌株的26S rDNA D1/D2區域。PCR擴增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 10 min，最后于4 ℃保存[12-13]。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的目標產物。所得產物委托給北京鼎國測序有限公司進行測定。

1.2.5 序列分析及系統發育樹的構建。在GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST search)，比較供試菌株與已知酵母菌之間的親緣關系及GenBank 核酸序列數據庫得到菌株注冊號。根據相關模式菌種的D1/D2區域序列，與供試菌的序列一起，用Clustal X軟件進行序列校準排齊，用Mega 5.0 軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)方法，進行1 000次Bootstrap 檢驗后構建系統發育樹[14-15]。

1.2.6 面團發酵力測定。 稱量70 g揉制好的面團迅速置于500 ml 的量筒中。用木棒將其填充實于量筒底部并將面團頂部壓平，記錄初體積。讀取體積時，將木棒伸入量筒內，使其低端輕觸面團最高部位，并貼于量筒讀數一側以減小讀數誤差，并每隔30 min測體積增長量。記錄第1小時的排水量(V1)和第4小時的排水量(V2)。用第4小時的排水量減去第1小時的排水量即為該酵母的發酵力[16]。

F(發酵力)=V2-V1

1.2.7 面團發酵前后的pH的測定。稱取10 g發酵前的面團，把它放入100 ml蒸餾水內，用組織搗碎機把它勻漿，離心并過濾。用pH計對其上清液進行pH測定。稱取10 g發酵后的面團，同樣的方法測定發酵后的面團pH。

1.2.8 面團醒發測定。 成形后的馕餅在28～29 ℃溫度下靜置，觀察其醒發情況。一般以達到成品體積的80%～90%為準。

1.2.9 感官測試。

1.2.9.1 和面。面粉 800 g，酵母菌 4 g，加碘精制鹽10 g，消毒純牛奶100 g，水250 ml(30 ℃)。將這些材料加入到真空和面機中，定速充分攪拌20 min。避免和面過程中人為因素造成差異。

1.2.9.2 面團發酵。將和好的面團置于醒發箱中，在28～29 ℃下進行發酵。避免發酵過程中人為因素造成誤差。

1.2.9.3 馕制作按照常見的方式制作。按照成品的重量要求，將面團短時間內分塊和稱重，搓面和靜置手工搓圓要領是掌心向下，五指握住面團，在面案上順一方向旋轉并向下輕壓，將面團搓成圓球形。在27～29 ℃進行靜置赤稱醒發。

1.2.9.4 馕餅的烤制。將發酵好的馕面團分割成適量大小，貼入溫度為150 ℃的環保電馕坑下進行打馕，烘烤。避免烤制過程中人為因素造成差異。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離 分別從烏魯木齊、阿爾泰、喀什3個地區采集了傳統馕面團樣品，分離了35株面包酵母(Saccharomycescerevisiae)。

2.2 系統發育進化分析 26S rDNA的D1/D2區序列的基礎上，將35株面包酵母菌測序結果與GenBank數據庫中已知菌的26S rDNA D1/D2區序列進行同源性比對，針對性地選擇了29株相互之間序列相似性為99%的面包酵母。用鄰近法(Neighbor-joining)對29株面包酵母進行構建系統發育進化樹，自展數(bootstrap)為1 000[14-15]，得到的系統發育進化樹如圖2所顯示。

圖2 相似性99%的釀酒酵母的26S rDNA D1/D2區序列的系統發育分析

2.3 初篩 根據29株面包酵母菌系統發育進化樹上所展示的進化距離的不同獲得了11個獨立的大分支(圖2)，并且從每個分支中選出了代表性的一株菌，將它作為此來源馕面團品種的代表。詳細結果見表1。

以下是此試驗首次篩選的11株酵母菌在基因庫的注冊號： K1(KM401544)，K24(KP120534)，40n(KP965903)，U10 (KP120525)，K47(KM454443)，U18(KP122529)，K28(KM454439)，K29(KP120537)，K6(KM454427)，33n(KP965907)，U5(KP120522)。

表1 11株代表面包酵母的篩選

2.4 母菌落形態與細胞形態觀察 首次篩選的11株面包酵母在YEPD培養基上28 ℃下培養后其菌落形態基本上相似，顏色均為乳白色，菌落形態為圓形，邊緣整齊，光滑，濕潤，中部為微凸。細胞形態均為圓形，生殖方式為出芽生殖。部分菌株的菌落形態及細胞顯微形態如圖3所示，圖中的無色為活細胞(圖3c)，藍色為死細胞(圖3d)。

注：a.Saccharomyces cerevisiae n40(同40n)菌落形態；b.Saccharomyces cerevisiae U10菌落形態；c.Saccharomyces cerevisiae K28顯微形態；d.Saccharomyces cerevisiae U10細胞顯微形態。圖3 部分供試菌株的菌落形態及細胞顯微形態

2.5 復篩

2.5.1 面團體積法測定酵母發酵力。 采用體積法對11株面包酵母菌株進行發酵性能檢測。產二氧化碳能力和發酵力成正比，產二氧化碳的能力越高說明該菌株發酵能力越高。從圖4中可知，菌株K24、40n、U10、K47、K28、33n使面團膨發體積相當大，在馕面團中的產氣能力高。該試驗中獲得了發酵力高的6株面包酵母。

圖4 不同酵母的發酵力

2.5.2 面團的pH。表2顯示的是11株菌面團發酵前后的pH，從以上結果可知它們在面團發酵前后的pH范圍為5.20～5.78，不會導致馕面團過酸過堿等現象，pH不會影響馕的口味。

2.5.3 醒發測定。圖5顯示11株酵母菌在面團醒發時間為17～28 min。其中K24、K47、33n、K28、40n和U18醒發時間較短，非常適合于快速醒發，能夠提高馕餅生產速率。

2.6 最終篩選

2.6.1 不同酵母對馕面團感官質量的影響。根據上述2次篩選，試驗獲得了發酵速度快、pH適當、醒發時間短的5株菌(K24、K47、33n、K28、40n)。在環保的馕坑里，175 ℃下進行打馕，并由5位評審員對馕進行感官測試。按照表3的馕感官質量評分尺度來進行打分。不同面包酵母發酵的馕感官評分結果見表4。從表4中可看出，5株面包酵母樣品發酵的馕，感官評價總分平均值由高到低依次為K24、K47、K28、40n、33n。其中K24的分數最高，因此該研究中K24確定為馕面團發酵的優質菌。

表2 11株菌在發酵面團前后的pH

圖5 不同菌株醒發時間

表3 馕感官質量評分標準

表4 不同面包酵母發酵的馕感官評價結果

注：酵母添加量 0.8%。

3 結論

該研究首次從新疆馕面團中篩選了優質的發酵酵母菌。根據系統發育進化樹上的進化距離，選擇了11株面包酵母菌。系統發育進化樹上的每個大分支能夠代表常見面包酵母的突變株。該試驗使用體積法對面團發酵力進行檢測。此法所需的設備簡單、直觀且可同時測定多個樣品，然而家庭、作坊及工業化生產制作饅頭、馕或面包時多憑經驗判斷，其經驗的主要指標便是面團體積的變化。因此，面團體積法測定酵母發酵力的研究顯得十分必要。該試驗檢測了面團發酵前后的pH。若馕面團對堿不足，打出來的馕會有較濃的酸味，對堿過量，馕表面發黃易開裂，風味也不好[17]。因此馕面團發酵中一定要控制pH不低于5。該試驗中面團培養范圍都在26～29 ℃，因為在這個溫度上酵母的產氣能力大，發酵力強，產氣量比較均勻，面團的持氣能力比較大。當溫度超過30 ℃時，酵母的量大，產氣的速度過快，不利于面團的持氣和充分膨脹，也容易引起面團中其他雜菌的繁殖而影響面包的質量。

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Selection of Excellent Yeast for Nang Dough in Xinjiang

Marygul Kurban, Mihribangul Abdurusul, Mehfuzem Abdurahman, Erkin Rahman*

(School of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046)

[Objective] To select excellent yeast for Nang dough. [Method] Collecting samples from Urumqi, Altai, Kashi in Xinjiang, the fermentation yeast for Nang dough was separated and purified with PDA and YEPD culture medium, 26S rDNA D1/D2 regional sequence determination and phylogenetic analysis was conducted. [Result] The experiment showed that, the 29 isolates’ 26S rDNA D1/D2 sequence homology was 99% each other. The phylogenetic evolution tree was constructed on the basis of 26S rDNA D1/D2 sequence and the 11 strains which were chosen by primary screening to consider as region’s special yeast strains. For further study the fermentation activity, pH and awaking time of the 11 strains were detected and the secondary screening was completed. By the sensory test finally got a high-quality yeast strain K24 (KM454437).The Nang dough fermentation yeast obtained in this study has a high quality of fermentation. [Conclusion] The obtained yeast has high fermentation efficiency, which will provide technical basis for processing industry of Xinjiang Nang.

Nang dough; Yeast; 26S rDNA D1/D2 region; Selection

烏魯木齊市科技創新種子資金項目(21061710)； 國家自然科學基金項目(U1203101)；國家自然科學基金項目(31060002)。

瑪依古麗·庫爾班(1988-)，女，維吾爾族，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向：資源微生物。*通訊作者，教授，博士，從事資源微生物研究。

2015-04-20

S 509.9

A

0517-6611(2015)17-302-04