食源性致病菌分子生物學檢測中菌體分離富集與DNA提取技術研究進展

董 妍,胡文忠,何煜波,姜愛麗,薩仁高娃

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116600;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

食源性致病菌分子生物學檢測中菌體分離富集與DNA提取技術研究進展

董 妍1,胡文忠2,*,何煜波2,姜愛麗2,薩仁高娃3

(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116600;2.大連民族學院生命科學學院,遼寧大連 116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116024)

食源性致病菌DNA的數量及純度嚴重影響后續分子生物學檢測的準確性和靈敏性,因此隨著分子生物學技術在食源性致病菌檢測中的應用日漸廣泛,細菌的分離、富集和DNA提取方法成為研究熱點之一。本文綜述了食源性致病菌的分離、富集和DNA提取的多種方法,以便研究開發更加快速、靈敏的分子生物學檢測技術。

食源性致病菌,分離,富集,DNA提取,分子生物學

近年來,由食源性致病菌污染食品而引起的食品安全問題在全球范圍內頻頻發生,如2008年荷蘭暴發的沙門氏菌污染奶酪和肉制品事件、2011年美國暴發的香瓜李斯特菌中毒事件、2014年日本發生的腸出血性大腸桿菌O157∶H7大規模污染黃瓜事件等,造成消費者感染和死亡,嚴重危害了人類生命健康,給食源性疾病的預防及控制工作帶來了巨大的挑戰,因此,食源性致病菌的快速檢測技術成為了國內外關注和研究的熱點之一。食源性致病菌的傳統檢測技術已經越來越不能滿足人們當今對食品質量與安全的要求,隨著食源性致病菌檢測技術的不斷發展,分子生物學技術因具有特異性強、靈敏度高、快速簡便等優點,已被廣泛應用于各類食品的食源性致病菌的檢測中。DNA提取是分子生物學檢測技術的基礎和關鍵技術環節之一,所提取的DNA的含量和質量不僅影響到檢測的速度,也影響著檢測的特異性和靈敏性。在食品中食源性致病菌的數量往往較少,而且存在著食品中的復雜基質影響分子生物學檢測的準確性和有效性。因此,檢測前對食源性致病菌進行分離、富集或選擇高效的DNA提取方法是實現快速、特異、靈敏檢測的重要基礎。本文對食源性致病菌的分離、富集方法以及其DNA的幾種提取方法進行了綜述,以期為食源性致病菌的監督與檢測、食源性疾病的預防與控制提供參考。

1 食源性致病菌的分離、富集技術

1.1 離心分離技術

離心分離技術主要是根據不同物質的沉降系數、質量、密度等因子的不同,利用離心力將菌懸液中的菌體與細菌培養液分開,使菌體脫離培養基質而富集在一起。離心分離技術普遍具有快速、簡便、成本低等特點,特別是應用密度梯度離心技術可以分離不同種類的細菌,是一種應用較廣泛的富集方法,但是離心分離技術還存在著粘附食品基質、大量細菌損失等缺點[1]。李引強[2]等人在應用試劑盒法提取牛奶樣品中細菌DNA前,對樣品進行了離心處理,基于16S rRNA-V3區克隆測序鑒定了細菌菌群,研究發現此方法可以提取到市售牛奶中的細菌DNA,并滿足下游的實驗要求。吳家林[3]等人用差速離心技術對豬肉模擬樣品進行前處理,在應用多重PCR技術檢測腸出血性大腸桿菌O157∶H7時,樣品預增菌4 h后檢測靈敏度能達到100CFU/mL。Fukushima[4]等人應用浮力密度梯度離心對食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等12種致病菌進行了分離并富集,應用活細胞計數和實時熒光定量PCR技術進行檢測后發現,富集后的菌體濃度是富集前的250倍,檢測靈敏度為101～103CFU/g。

1.2 改良増菌培養基富集法

應用増菌培養基的前増菌過程可以增加致病菌的數量,從而有效提高致病菌的濃度,特別是選擇性増菌能夠抑制雜菌,提高檢出率和準確性。對増菌培養基的改良主要體現在提高増菌效率、研究共増菌培養基等方面[5]。于海霞[6]等人對山梨醇麥康凱培養基和M-WS培養基對食品檢驗中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的分離能力進行了比較研究,M-WS培養基表現出了較強的抗雜菌干擾的能力,提高了食品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的分離效率和檢出率。呂曉萌[7]等人對PCR法檢測大腸桿菌的增殖條件進行了優化研究,研究發現在LB培養基中添加0.3 g/100 mL的甘露醇和1.0%的乳糖,并輔以37 ℃、150 r/min的振蕩培養,大腸桿菌的增殖效果最佳。翁思聰[8]等人設計了一種復合型増菌培養基可以使副溶血性弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等4種水產品中常見的致病菌在同一培養基中生長,減少了培養基對多重PCR檢測的影響,大幅度提高了檢測效率。趙廣英[9]等人以魚蛋白胨為基礎,改良了水產品中副溶血弧菌的増菌培養基,取得了較好的富集效果。

1.3 膜分離技術

高分子薄膜以壓力差、濃度差等外界能量位差為推動力,可以對致病菌進行分離和富集。膜分離技術具有簡便、快速、成本低等特點。但是分離后的細菌常濃縮于食品或濾膜上,還需要進一步洗脫和分離,并且洗脫效果嚴重影響著細菌的回收率,胡朝友[10]等人對僅輔以渦旋的膜洗脫方法進行了回收率的研究,發現較低濃度的菌體應用膜洗脫方法的回收率較低,濃度最低的回收率不足20%,針對此問題對應用濾膜富集飲用水中大腸桿菌的方法進行優化,結果表明在膜過濾前向水樣中加入高濃度表皮葡萄球菌可以提高低濃度大腸桿菌的洗脫效率,并在膜過濾后采用渦旋和玻璃棒刮擦的方法處理濾膜,洗脫效率達74%～95%,對1000 mL不同濃度大腸桿菌進行富集和DNA提取后,全程的回收率為79.7%～104.0%,結合TaqMan探針實時熒光PCR技術的靈敏度為1 CFU/mL。Fitzmaurice[11]等人比較了膜分離技術和免疫磁性分離技術分別對牛肉樣品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的富集能力,結合多重PCR反應檢測后發現,當細菌增殖時間大于16 h時,牛肉樣品中菌含量達到log109.6-7.5CFU/mL,膜分離技術可以達到與免疫磁性分離技術相當的富集能力。Jeníková[12]等人在對食品中沙門氏菌應用IMS-PCR技術進行檢測前,將預富集樣品通過應用膜分離技術制成的過濾袋,以去除食物殘渣,降低了食物基質對檢測的負面影響,提高了檢測效率。

1.4 免疫磁性分離技術

免疫磁性分離技術利用相關抗體能夠與細菌細胞表面抗原特異性結合的原理,以磁性物質為中介,在外磁場的作用下將致病菌從培養環境中分離出來。免疫磁性分離技術具有特異性強、靈敏度高、分離效果好等優點,但同時也存在著成本高、需要預處理、不適合大體積樣品分離等缺點[1]。Xiong[13]等人對檢測食品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的免疫磁性分離技術進行了優化,優化后對細菌數量為101～106CFU/mL、磁珠用量為0.05 mg的腸出血性大腸桿菌O157∶H7捕獲效率大于98%,對碎牛肉和牛奶樣品中腸出血性大腸桿菌O157∶H7的捕獲效率分別為94.4%和99.8%。Ma[14]等人使用基于免疫磁性分離技術的多重實時PCR技術同時檢測新鮮豬肉中的沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌,靈敏度分別為2.0、6.8、9.6 CFU/g。Wang[15]等人將免疫磁性分離技術、疊氮溴化丙錠(PMA)、脫氧膽酸鈉(SD)與qPCR技術結合檢測牛奶樣品中的腸出血性大腸桿菌O157∶H7,消除了死菌對檢測的干擾,檢出限為102CFU/mL。Zheng[16]等人應用實時PCR法結合免疫磁性分離技術對鴨翅原料中的鼠傷寒沙門氏菌進行了檢測,檢測時間為10 h,檢出限為103CFU/mL。

近年來,納米級磁性材料被廣泛應用于食源性致病菌的分離中,納米級磁性材料比普通的磁性微珠更加穩定,并且在擴散速度、與目標菌的結合能力等方面更強,具有快速、高效、抗干擾能力強等優點,但是同時也存在著對環境要求高、分離體積小等缺點[1]。鐘子清[17]等人比較了抗體直接偶聯、鏈霉親和素-生物素介導偶聯的納米級免疫磁珠以及磁珠大小對單增李斯特菌捕獲效率的影響,研究發現采用鏈霉親和素-生物素介導偶聯的180 nm免疫磁珠可以高效的富集單增李斯特菌。Yang[18]等人應用納米級免疫磁性粒子結合實時定量PCR技術檢測牛奶樣品中的單增李斯特菌,捕獲效率是普通免疫磁性分離的1.4～26倍,檢測的靈敏度為452 CFU/mL。Yang[19]等人應用納米磁珠分離食品中的鼠傷寒沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7和李斯特菌菌細胞,并結合PMA-PCR檢測技術,食品樣本中的檢出限為103CFU/mL。

2 食源性致病菌DNA的提取技術

2.1 有機溶劑抽提法

有機溶劑抽提法在致病菌DNA提取中應用較為廣泛,也是許多改良方法的基礎,主要是利用蛋白酶K等破碎菌細胞,用酚-氯仿等有機溶劑除去蛋白質,最后用乙醇等沉淀DNA。此方法雖然提取效率較高、DNA純度較好,但存在著操作繁瑣、干擾后續反應、有一定毒性等缺點。Gordillo[20]等人對肉制品中的腸出血性大腸桿菌O157∶H7進行煮沸冷卻和溶菌酶處理后,應用酚/氯仿混合物、乙醇等有機物提取DNA,結合qPCR技術檢測,富集后檢測限為1 CFU/g,檢測時間8 h。Fakruddin[21]等人應用酚/氯仿-乙醇方法分離斑節對蝦中出血性大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、霍亂弧菌和副溶血性弧菌的DNA,并結合多重PCR反應進行檢測,獲得了良好的特異性和靈敏性。Kawasaki[22]等人對肉類、魚等食品中沙門氏菌、單增李斯特菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7進行了多重PCR檢測,應用異硫氰酸胍和異丙醇等有機物提取細菌DNA,經20 h増菌的人工接種樣品的檢出限為5 CFU/25 g,同時對食品在冷凍儲藏期內致病菌的檢出率進行了監測。

2.2 水煮法

水煮法利用高溫破碎菌細胞,并使蛋白質變性而收集DNA。此方法簡單、快速,且成本較低。但同時應用水煮法提取食品樣品中致病菌的DNA時,DNA的純度在很大程度上會受到食品樣品種類的影響,陳偉[23]等人應用水煮法提取肉制品中志賀氏菌的DNA,以研究其對PCR檢測靈敏度的影響,此方法所提取DNA的OD260/OD280的值為1.0252,檢出限為5×103CFU/mL,分析認為應用水煮法處理肉制品使得產物中含有大量的蛋白質等雜質,降低了產物的純度,從而影響檢測的靈敏度。Zarei[24]等人應用水煮法提取多種肉類產品中的腸出血性大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌的DNA,結合多重PCR反應分析了伊朗西南部肉類商品中兩種致病菌的檢出率。Kim[25]等人在應用熒光定量PCR反應檢測鮮切甘藍中腸出血性大腸桿菌時,采用水煮法提取細菌DNA,檢測時間少于9 h,檢出限為1.53 log CFU/mL。Son[26]等人應用水煮法對五種產志賀毒素大腸桿菌提取DNA,進行了多重PCR反應檢測并應用于人工接種的菠菜、苜蓿芽和香菜中,此方法具有快速、特異的特點。

2.3 Triton X-100裂解法

Triton X-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚,是烷基酚與環氧乙烷的縮合物,屬于非離子型表面活性劑,可使膜蛋白充分溶解從而分離DNA,此方法簡單、快速。但當使用此方法提取某些具有莢膜等結構的細菌時所得DNA的純度不高,蘇麗婷[27]等人對應用Triton X-100裂解法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA進行了研究,發現所提取DNA的OD260/OD280值一般在0.69左右,PCR檢測的靈敏度不高。Vidal[28]等人對引起食源性疾病暴發的三種致瀉性大腸桿菌(腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、產腸毒素大腸桿菌)進行多重PCR檢測時,采用了0.5%的Triton X-100煮沸提取致病菌的DNA。徐偉[29]等人分別用Triton X-100法、溶菌酶+蛋白酶K法、Tween-20法提取滅菌脫脂乳中的單增李斯特菌和志賀氏菌DNA,進行比較后發現,Triton X-100法和Tween-20法符合檢測要求,應用多重PCR技術檢測后,檢出限分別為2 CFU/25 mL、1.6 CFU/25 mL。魏華[30]等人比較了水煮法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法對大腸桿菌DNA的提取效果,并結合ERIC-PCR技術進行檢測,結果表明三種提取方法效果一致,均可獲得應用于ERIC-PCR技術的有效擴增模板。

2.4 Chelex-100法

Chelex-100是一種聚苯乙烯基體離子交換樹脂,該樹脂懸液可以在堿性、100 ℃的條件下破碎菌細胞并使蛋白質變性,從而釋放DNA。Chelex-100法可螯合金屬離子,在煮沸過程中能夠保護DNA并減少抑制PCR反應的物質,操作簡單、快速,但其所提取的DNA純度不如用試劑盒法所提取DNA的純度[31],并且所提取的DNA保存時間超過6個月會影響PCR實驗的重復性[32]。錢雪琴[33]等人采用Chelex-100法提取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的DNA,利用通用引物擴增16SrDNA片段檢測兩種菌的靈敏度均為1.2×101CFU/mL。鄭鳴[34]等人將Chelex-100法與環介導間接聚合酶鏈式反應結合檢測肉制品中的單增李斯特菌,人工污染的鮮肉和牛奶檢的靈敏度均為100 CFU/g(mL),對市場上200份不同的肉制品進行了檢測,陽性率與傳統培養法一致。Malorny[35]等人應用Chelex-100法提取食品中的沙門氏菌并應用熒光定量PCR技術進行檢測,對多株沙門氏菌菌株和非沙門氏菌菌株檢測的檢出率為100%時,檢出限為104CFU/mL,對110種食品樣本檢測的準確性為100%。

2.5 FTA濾膜法

FTA(Flinders Technology Associates,FTA)濾膜或FTA卡是一種特制的濾膜,它可以裂解細胞并將DNA吸附在其上,經干燥后長期保存DNA。此方法能夠去除雜質及抑制PCR反應的物質,無需洗脫DNA避免了DNA的損失,簡單快速。Lampel[36]等人將FTA濾膜法與PCR反應結合,分別對農產品、牛肉等幾種食品中的志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和李斯特菌進行了檢測,志賀氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的靈敏度為30～50 CFU/mL,李斯特菌的靈敏度為200 CFU/mL。任立松[37]等人應用水煮法、FTA濾膜法、試劑盒法分別對阪崎腸桿菌提取DNA,并應用于環介導等溫擴增技術中,發現應用FTA濾膜法和試劑盒法提取DNA效果優于水煮法,FTA濾膜法更簡單、快速,靈敏度為103CFU/mL。但是應用此方法時需對濾膜大小等參數進行優化,并且卡片本身含有少量抑制PCR反應的物質,陳霖祥[38]等人針對此問題對FTA樣品卡的大小和卡片上DNA提取量進行了優化,發現6.0×104-7CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液制備的0.5 mm卡片在熒光PCR-16S rDNA測序反應中Cp值較好。

2.6 磁性材料吸附法

選擇與致病菌特異性基因片段互補的寡核苷酸片段修飾磁性材料,可以選擇性的分離目標DNA,此方法具有靈敏、快速、雜質干擾小的特點,但是對生物親和分子和磁場的要求高[1]。Amagliani[39]等人應用順磁性納米粒子分離牛奶樣品中的李斯特菌,結合PCR檢測技術,靈敏度為10 CFU/mL,與應用柱分離技術商品提取的DNA相比,靈敏度提高了10倍。隨后Amagliani[40]等人還使用了氨基改性的順磁性納米粒子分離海產品中的沙門氏菌和李斯特菌的DNA,結合三重熒光定量PCR檢測技術,能夠對増菌前細菌濃度為1 CFU/g的樣品進行檢測,與標準檢測方法結果一致。Omiccioli[41]等人采用磁性材料從牛奶樣品中提取沙門氏菌、單增李斯特菌和腸出血性大腸桿菌O157∶H7的DNA,并應用于多重PCR反應中,能夠檢測出菌濃度為10 cells/mL的牛奶樣品。

3 展望

目前,食品安全問題是全球關注的焦點,其中由食源性致病菌引起的食源性疾病因具有高發病率、高致死率、傳播能力強等特點,成為食品安全問題中的首要問題,據統計,我國每年發生細菌性食物中毒占食物中毒事件的30%～90%,其中人數占60%～90%[42]。食品基質會對其中致病菌DNA的分離和提取造成很大的影響,繼而影響檢測的靈敏性。食品基質主要的影響作用體現在兩方面:一是食品基質經破碎處理后,殘留物質與致病菌相比體積依然較大,此時致病菌會粘附在食品基質上,不利于分離,造成所得致病菌數量小于實際食品中致病菌的數量,易造成漏檢的結果[1];二是食品基質中存在著干擾PCR檢測的物質,比如在肉制品中存在著脂肪、金屬離子等抑制PCR反應的物質[23],在乳品中抑制PCR反應的物質主要是脂肪、多糖、蛋白質等[43],并且不同食品基質中同種抑制因子也會對PCR檢測產生不同影響,楊洋[44]等人研究發現從全脂乳和脫脂乳中提取金黃色葡萄球菌的DNA,與從干酪中提取金黃色葡萄球菌的DNA相比,前者用于PCR檢測的效果更好,主要原因是后者的脂肪含量遠高于前者,影響了致病菌DNA的提取和PCR檢測。因此,對不同種類食品中的食源性致病菌建立快速、靈敏、特異、準確的分子生物學檢測技術,對有效控制食源性致病菌的傳播、預防食源性疾病的暴發至關重要。研究在短時間內獲得大量的、高純度的細菌基因組DNA的富集、提取方法以滿足檢測效率、檢出限的要求,具有著重要的實際意義。

在今后的研究中,對食源性致病菌的分離、富集以及DNA提取的研究主要發展趨勢主要有以下四點。首先,要簡化DNA提取步驟,避免反復提取而造成DNA的損失,同時也能夠縮短提取時間,從而提高檢測效率。第二,要加強對提高DNA純度的研究,在分離、富集過程中盡量選擇特異性富集,提取過程中盡量去除蛋白質、RNA等物質,以滿足分子生物學技術高特異性、高靈敏性的要求。第三,避免采用對PCR反應抑制作用強烈、對環境有污染、破壞DNA的富集和提取方法。第四,要研究具有較強分離能力的分離方法,并針對不同樣品中抑制PCR反應物質的特點,采用適合的提取方式。

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Research progress in separation,enrichment and DNA extraction of foodborne pathogens based on molecular biological technology

DONG Yan1,HU Wen-zhong2,*,HE Yu-bo2,JIANG Ai-li2,SA-Ren-gao-wa3

(1.College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Life Science,Dalian Nationalities University,Dalian 116600,China;3.College of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

The quantity and purity of foodborne pathogens’ DNA affect the accuracy and sensitivity of molecular biological technology seriously. The separation,enrichment and DNA extraction of bacteria in detecting foodborne pathogens become research hotspot with the application of molecular biological technology. In this paper,the separation,enrichment and DNA extraction of foodborne pathogens are summarized to development more rapid and sensitive molecular biological technology.

foodborne pathogens;separation;enrichment;DNA extraction;molecular biology

2015-02-09

董妍(1989-),女,在讀碩士,研究方向:食品安全,E-mail:dong_yan@126.com。

*通訊作者:胡文忠(1959-),男,博士,教授,研究方向:食品科學,E-mail:hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B05);國家自然科學基金項目(31172009);大連科技計劃項目(2012E13SF106)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)23-0371-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.069