加工導致的花生過敏原蛋白結構變化及其對性質的影響

趙瑞芳,吳志華,連 君,詹少德,王 娟,姚志文,陳紅兵,袁娟麗

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大學新聞與傳播學院,江西南昌 330031;4.南昌航空大學工程訓練中心,江西南昌 330063;5.南昌大學藥學院藥理教研室,江西南昌 330006)

加工導致的花生過敏原蛋白結構變化及其對性質的影響

趙瑞芳1,2,吳志華1,2,連 君1,2,詹少德1,2,王 娟3,姚志文4,陳紅兵1,2,袁娟麗1,5,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學中德聯合研究院,江西南昌 330047;3.南昌大學新聞與傳播學院,江西南昌 330031;4.南昌航空大學工程訓練中心,江西南昌 330063;5.南昌大學藥學院藥理教研室,江西南昌 330006)

花生是世界糧農組織(FAO)認證的八大過敏食物之一,花生可導致嚴重的過敏反應,甚至危及生命。由于花生作為食物配料有廣泛的應用,人們對花生過敏越來越關注。本文對加工后花生過敏原蛋白結構變化與性質變化之間的關系研究進行了綜述,為探索加工定向改變花生過敏原蛋白的結構和性質提供方向。

花生,過敏原,結構,致敏性

隨著人們生活質量的提高,食物過敏等食品安全問題已成為全球關注的問題。據世界糧農組織(FAO)1995年報告,90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼水產品、花生、大豆、堅果類和小麥引起,花生屬于這八大食品之一,是重要的食物過敏原[1]。目前發現的花生過敏原蛋白有12種,可以歸類為4種常見的食物過敏原家族:Cupin超家族(Ara h 1,3),醇溶蛋白超家族(Ara h 2,6,7,9),抑制蛋白家族(Ara h 5),Bet V1同源蛋白(Ara h 8)以及另外兩種:Oleosin油質蛋白(Ara h 10,11),Defensin抵抗素(Ara h 12,13)。食物過敏原中能夠被50%以上的病人的血清所識別的就被認為是主要的過敏原,其中Ara h 1和Ara h 3、Ara h 2和Ara h 6都被認定是花生中主要的過敏原蛋白[2]。

作為食品的花生通常是經過了加工處理,而花生制品的加工工藝繁多,不同的加工方式會不同程度地改變花生過敏原蛋白的數量和結構,進而影響其性質。對于加工引起的過敏原蛋白性質的變化,現階段關注較多的包括致敏性、分子聚集特性,消化吸收性以及其它加工特性(如乳化性、起泡性等)。研究試圖通過考察結構變化引起性質變化的規律,探索不同加工方法對花生過敏原蛋白性質,尤其是致敏性的定向影響。

1 致敏性

加工導致的過敏原結構變化,直接影響到它們的致敏性。比如Hansen等[3]的研究表明,熱處理可以導致蛋白質變性破壞其構象性表位,因此,蛋白質變性可以解釋榛子粉類過敏原加熱后90%的免疫反應性喪失的現象。然而,Mondoulet等[4]對花生進行烘焙處理,發現烘焙后花生蛋白的致敏性卻增強了。這可能是由于烘焙導致花生蛋白與還原糖發生美拉德反應,產生新的免疫反應性結構,增強其致敏性;同時Ara h 2可以保護Ara h 1不被胰蛋白酶降解,而烘焙又可以提高這種保護作用。Starkl等[5]也做了烘焙加工,發現Ara h 2分子可以發生交叉連接,形成結構更穩定的三聚體或六聚體等復合物,與IgE的結合能力增強。

Beyer等[6]的研究表明,在對花生進行煎炸(120 ℃)的加工中發現,煎炸會引起Ara h 1二級結構中β-結構舒展,但是ELISA實驗表明Ara h 1引起過敏的能力并沒有被影響。而煎炸后的花生中過敏原蛋白Ara h 1的提取率卻逐步降低了,150 ℃以上時基本降為零,這可能是由于加熱引起蛋白質的聚合引起的,這種聚合又減少了與IgE結合的過敏原數量,使得蛋白的致敏性下降。Blanc等[7]研究也表明,花生經煎炸后所含的Ara h 1單體和三聚體數量減少,從而降低Ara h 1與IgE的結合能力,影響其致敏性。

水煮也被報道可以降低花生的致敏性,Mondoulet等[4]對花生進行了水煮加工,他認為水煮后花生致敏性的降低是過敏原數量損失導致的,與其結構變化沒有關系。用ELISA法檢測表明,確實有部分過敏原蛋白進入到了水煮液中,這與Beyer等[6]的研究結果一致。然而也有研究表明,結構上的變化也可以導致水煮花生致敏性的降低,Schmitt等[8]的研究發現,水煮過程中過敏原蛋白有較少的聚集體形成,且這種聚集體不溶于水,從而抑制或降低了美拉德反應,減少了免疫反應性結構的形成,進而降低其致敏性。Blanc等[7]也發現,水煮加工后Ara h 1聚集起來,蛋白的二級結構部分丟失,這也導致致敏性降低。

高壓微射流可以改變過敏原蛋白二級結構中的α-螺旋結構,從而影響其致敏性。Hu等[9]用高壓微射流技術處理花生蛋白 Ara h 2,用圓二色譜法和ELISA實驗發現α-螺旋含量降低的同時檢測到的抗原性也顯著降低,這可能是由于位于過敏原蛋白α-螺旋位置處的IgG結合表位被破壞或掩蓋。Cabanillas等[10]用高壓處理烘焙過的花生也得到了同樣的結果,證明了高壓可以通過破壞或者掩蓋位于α-螺旋區域的IgE結合表位降低致敏性。另外,Luo等[11]是利用γ輻照Ara h 6過敏原蛋白發現,輻照也可以使蛋白質二級結構中α-螺旋損失,同時免疫印跡法和間接ELISA法檢測到其與IgG結合的能力降低,進一步證明了α-螺旋結構與花生過敏原致敏性之間密切的關系。Hu等[9]的研究表明超高壓微射流處理還可以破壞Ara h 2的二硫鍵,二硫鍵對維持IgG或IgE結合表位的構象有重要的作用,這也是超高壓微射流降低其致敏性的另外一個原因。

酶消化是近幾年來研究花生過敏原致敏性的新方法之一,主要是將蛋白水解為小的片段,酶作用時可能破壞其過敏原表位。為了研究過敏原蛋白在人體內消化后的致敏性變化情況,實驗室經常使用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬人體胃液和腸液消化。比如,Yu等[12]利用α-糜蛋白酶和胰蛋白酶水解烘烤花生中Ara h 1和Ara h 2蛋白,并運用ELISA實驗和免疫印跡法分析發現水解后其致敏性顯著降低。主要是兩種酶同時作用時,由于酶作用位點不同,它們能夠以互補的方式水解過敏原蛋白,增強水解效果。Ara h 1和Ara h 2水解為小的片段,在可溶性蛋白中完整形式的Ara h 1和Ara h 2含量幾乎降為零。Eiwegger等[13]先利用胃蛋白酶消化花生粗蛋白,再用十二指腸液消化,胃消化后保留的肽段在十二指腸消化后會進一步被分解,并運用人血清的免疫印跡實驗、淋巴細胞免疫刺激實驗評估發現胃十二指腸消化后,即使沒有完整的蛋白存在,小的片段仍然具有致敏的潛力。酶作用時會導致部分過敏原表位的破壞,但是同時暴露出了天然蛋白結構內部的過敏原表位,這使得致敏性變化不大。而王金水等[14]是使用枯草芽孢桿菌對冷榨花生蛋白粉進行液態發酵,由SDS-PAGE法發現高壓與發酵相結合對花生蛋白有著很好的降解效果,進而可以降低其致敏性。

酶交聯是現代食品加工的一種新方法,過敏原蛋白在交聯和聚集的過程中,結構的變化也可能導致過敏原表位被掩蓋或改變進而影響其致敏性。比如,Chung等[15]分別將生花生和烘焙花生與過氧化物酶(OPD)混合,IgE的結合能力實驗表明烘焙花生交聯后其致敏性降低。從SDS-PAGE電泳結果可以明顯的發現,烘焙花生中Ara h 1,Ara h 2過敏原單體的量顯著減少,而且有蛋白質聚合體的形成,而生花生中的過敏原蛋白由于其過氧化物酶的交聯位點(酪氨酸)隱藏,蛋白質之間不發生交聯反應而致敏性基本不受影響。而Clare等[16]利用轉谷氨酰胺酶交聯Ara h 1發現,Ara h 1能夠交聯形成聚合物,但是通過ELISA實驗發現該聚合物與IgE的結合能力并沒有發生顯著變化。除了酶交聯外,花生過敏原也可以與其它物質作用形成聚合物,如Chung等[17]將花生可溶性過敏原與植酸非共價結合,用間接ELISA法測定發現,IgE結合能力沒有變化,主要是由于沒有改變IgE結合位點,但是通過形成復合物減少了過敏原含量,也降低了致敏性。

許舒婷等[18]用微粒輻射產生的電子輻照處理花生粗分離蛋白,處理后的蛋白質二級、三級結構遭到破壞,引起分子變形、凝聚、粘度下降,從而導致過敏原溶液的濃度改變,進而影響其致敏性。

加工導致的過敏原蛋白致敏性的變化可由多種因素引起,例如加工使得二級結構中α-螺旋處結構發生變化,可能導致該處的IgG結合表位被破壞或掩蓋,加工時蛋白之間發生聚集也可能掩蓋表位或產生新的免疫反應性結構,從而引起致敏性的變化。這些致敏性的改變,主要與過敏原表位結構自身的變化有關。

2 分子的聚集特性

蛋白質是由氨基酸分子由肽鍵相互連接而成的高分子化合物,不同的加工條件可能導致花生中蛋白質分子發生不同程度的聚集。現有的實驗研究表明,高度聚集蛋白質的形成可能是通過包括二硫鍵在內的共價交聯,以及諸如氫鍵、鹽橋,尤其是疏水相互作用等的非共價相互作用,形成較大的聚集體[19]。

已有報道關注了這些變化,例如,Maleki等[20]采用烘焙方式處理花生,發現在烘焙過程中花生中的蛋白質會與還原糖發生美拉德反應,形成一種結構多樣的復合物進而改變其聚集性。Vissers等[21]對分離純化的Ara h 1、Ara h 2/6也做了烘烤的研究,從SDS-PAGE電泳實驗以及動態光散射實驗發現,加入葡萄糖加熱時,有多肽聚合物產生。溶解性是蛋白質其他功能特性的基礎,溶解度也可以用來表征花生分離蛋白的聚集程度[22]。Schmitt等[8]分別對花生蛋白中可溶的和不可溶的部分進行水煮處理,發現水煮使得整體蛋白的溶解性降低,說明水煮過程中過敏原蛋白可能發生了聚集,產生了大的復合物從而降低溶解度。顧煒等[23]用噴射蒸煮處理花生分離蛋白,并用SDS-PAGE電泳法發現電泳條帶上端有大分子量的聚合物產生。熒光光譜分析發現,經過處理后花生分離蛋白完全變性,原本處于蛋白質內部的疏水氨基酸殘基伸展,暴露于溶劑中,可能正是由于這些結構的變化引起了蛋白質聚集特性的改變。

酶交聯主要利用一種或多種酶催化蛋白質內部多肽鏈之間或者是蛋白質分子之間形成新的共價鍵,從而交聯形成大的聚合物。通過蛋白質交聯可改變食品組織結構和功能性質,因此蛋白質交聯在食品中有較廣闊應用前景[24]。

Radosavljevic等[25]利用多酚氧化酶交聯花生粗蛋白,再以掃描電子顯微鏡和電泳法結合觀察發現,多酚氧化酶處理可以促進花生中主要過敏原蛋白發生交聯產生高分子量的聚合物。Clare等[16]用轉谷氨酰胺酶交聯花生蛋白發現,Ara h 1基本都能被交聯形成聚合物,而Ara h 2卻很難發生交聯反應。Ara h 2中的轉谷氨酰胺酶的酶催化位點之一賴氨酸可能被折疊掩蓋,因而較難發生交聯反應。Chung等[26]將花生粗蛋白與酚類物質(苯酚樹脂、咖啡酸、阿魏酸)作用,運用SDS-PAGE電泳法檢測發現,酚類物質可以與花生蛋白結合形成復合物,并且證實了聚合物中有兩種主要的花生過敏原蛋白存在。

廖玉等[22]利用脂肪氧合酶催化亞油酸氧化的反應體系對花生分離蛋白進行不同程度的氧化修飾,運用激光納米粒度測定儀測定聚集性的變化發現,隨著氧化程度的加深,花生蛋白粒徑增大。這可能是由于氧化引起疏水基團暴露,又由于暴露的疏水基團的相互作用蛋白質生成可溶性聚集體,平均粒徑變大,并隨著進一步的氧化最終生成不可溶性聚集體。

酶促交聯,熱加工及氧化修飾等加工方式都可以改變過敏原蛋白的聚集特性。酶可以促進蛋白質內部多肽鏈之間或者是蛋白質分子之間形成新的共價鍵,從而形成大的復合物,而熱加工和氧化修飾都可能引起蛋白內疏水基團暴露,從而增強蛋白之間的相互作用進而改變聚集狀態。

3 消化吸收性

高壓引起的結構的變化可以改變過敏原蛋白的消化性。Cabanillas等[10]對花生進行烘焙和高壓烘焙處理發現,與單獨烘焙花生相比,高壓處理后的烘焙花生蛋白更易被胰蛋白酶消化。圓二色譜實驗顯示在高壓條件下花生蛋白結構發生了伸展,這使得蛋白更易被消化,且加熱可以增強花生蛋白對胰蛋白酶的敏感性。另外,Hu等[9]做了高壓微射流的研究,發現高壓可以通過破壞二硫鍵來增強蛋白的消化性,MarzbanG等[10]的研究也證明,含有IgE表位的碎片可以抵抗酶的消化,但是當其二硫鍵被破壞時,這些碎片就會被快速消化。

多個研究表明,熱處理也可以通過改變酶作用位點影響過敏原蛋白的消化性。例如,Yu等[27]的研究表明,與生花生相比,烘焙花生中的過敏原蛋白Ara h 1、Ara h 2對α-糜蛋白酶更加敏感。首先烘焙可以破壞酶抑制劑,且由于α-糜蛋白酶的結合位點是疏水性的,烘焙可以暴露特定的疏水性氨基酸(酪氨酸,苯丙氨酸,色氨酸等),增多了α-糜蛋白酶的結合位點進而可以增強消化性。烘焙過程中與還原糖的美拉德反應也會改變過敏原蛋白的酶作用位點,Teodorowicz等[28]就研究了加葡萄糖和不加葡萄糖的情況下烘焙對Ara h 1胃蛋白酶消化性的影響,并利用裂解肽段的程度來評估水解的程度。研究表明,葡萄糖不存在時加熱沒有改變Ara h 1的胃蛋白酶水解度,而加入葡萄糖后由于Ara h 1的糖基化反應,改變了Ara h 1構象中的胃蛋白酶酶作用位點,水解度顯著降低,且美拉德反應的高級階段可以促進Ara h 1發生交聯反應[29-32],水解酶不能接近酶交聯位點的多肽而進一步阻止水解作用[33]。

過敏原蛋白的抗消化性與二硫鍵有著密切的關系,Shi等[34]的研究發現胃蛋白酶水解后Ara h 2仍具有較強的抗消化性,這主要是由于Ara h 2結構中的八個半胱氨酸殘基及二硫鍵可以穩定α-螺旋等核心結構,抵抗酶水解[35]。Koppelman等[36]也利用胃蛋白酶消化花生過敏原蛋白得到了同樣的結果;并且發現Ara h 1和Ara h 3在較低濃度胃蛋白酶作用下就能迅速的被降解,并用SDS-PAGE電泳法證實,分子間不存在二硫鍵,三聚體和低聚物[37-38]的形成由非二硫鍵連接不能形成穩定的抗消化結構,這與Thomas[39]的研究結果一致。

Teodorowicz等[40]向純的Ara h 1蛋白中混合適量葡萄糖使其發生蛋白糖基化反應。用Caco-2細胞模型測定發現不經過任何處理的Arah 1蛋白能夠抑制Caco-2細胞的增殖以及白細胞介素-8的分泌,糖基化后的Arah 1抑制能力減弱,且經胃蛋白酶水解發現,水解前其抑制效果比水解后明顯,這說明可能是較大的結構起了重要的抑制作用。

4 其它性質

花生過敏原蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩定性、起泡性等其它性質也會隨著花生加工的不同而發生不同程度的改變。

Liu等[41]在60 ℃下分別干熱處理花生分離蛋白1、4、7 d,利用差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimetry/DSC)、發射熒光光譜法、圓二色譜法研究發現,熱處理后花生分離蛋白由于與葡萄聚糖發生了美拉德反應,限制了蛋白質間的相互作用,進而提升其溶解性和穩定性;溶解性的提升又使得蛋白質分子能夠快速的轉移到水油交界面進而提升其起泡性,而作為非表面活性的親水性多糖,葡聚糖可以顯著的提升蛋白質的泡沫穩定性。

任嬌艷等[42]通過轉谷氨酰胺酶對低溫花生粕分離蛋白進行交聯改性,發現交聯反應后花生蛋白的功能特性發生改變。隨著交聯程度的增加,高分子不溶聚合物的生成以及蛋白結構的變化導致蛋白質溶解性下降;交聯后其乳化性和乳化穩定性提高,但交聯時間過長又會導致其制備的乳狀液乳化活性及穩定性顯著降低。DSC測定熱穩定性表明,交聯處理后花生分離蛋白熱穩定性提高,這可能主要歸因于轉谷氨酰胺酶催化的交聯反應產生了大量的高能異肽共價鍵。

涂宗財等[43]對花生蛋白進行高壓微射流處理發現,花生蛋白質在壓力猛烈釋放過程中一些對壓力敏感的非共價鍵(氫鍵、離子鍵和疏水鍵)受到了強烈的影響,導致蛋白質的微細結構發生變化,粒度尺寸變小和分布范圍集中,進而改變了其溶解性。壓力使得花生蛋白體積減小,疏水結構暴露出來,蛋白質表面疏水性增強,進而提升了其乳化性和起泡性。

Hu等[44]不僅研究了單獨的微射流處理和轉谷氨酰胺酶交聯,還將交聯處理與微射流相結合作用于花生蛋白。作者運用傅里葉變換紅外光譜和圓二色光譜測定發現,單獨的微射流處理或者轉谷氨酰胺酶交聯可以引起花生分離蛋白結構的展開,進而使得α-螺旋和β-轉角減少,β-折疊和隨機卷曲增多,花生分離蛋白的溶解性、乳化性以及表面疏水性顯著提升,并且作者發現混合兩種加工方式處理會使得花生分離蛋白形成更松散的結構,進而導致花生蛋白的功能特性更顯著改善。

一些化學修飾的方法同樣可以改變蛋白質的功能特性,如蛋白質磷酸化已經被認為是提高蛋白功能特性的有效手段,熊柳等[45]的研究表明,磷酸化改性后花生蛋白的乳化性、乳化穩定性、泡沫穩定性也都有不同程度的提高。Zhao等[46]用堿性蛋白酶水解花生分離蛋白發現,水解使花生分離蛋白的構象和功能特性得到顯著地改善。與花生分離蛋白相比,花生分離蛋白水解產物有更多松動的三級結構,并表現出較好的熱穩定性,溶解性和凝膠形成能力。

5 展望

花生過敏反應是IgE介導的Ⅰ型超敏反應,花生過敏反應可發生在各個年齡段,輕可出現口腔粘膜過敏、皮膚蕁麻疹等,重可出現危及生命的嚴重咽喉水腫、急性哮喘、過敏性休克,甚至導致死亡[47],這限制了花生在食品工業中的應用。

不同的加工方法對過敏原蛋白性質的影響各不相同,但是這些性質的變化都與內部結構變化有關,結構的變化與性質變化之間的聯系是我們定向改變蛋白質性質的基礎。蛋白質二級結構的變化可以直接影響致敏性,尤其是α-螺旋量的減少與致敏性的降低有密切的關系,這主要是由于α-螺旋處的過敏原表位被破壞或掩蓋,聚集也能掩蓋α-螺旋處的過敏原表位,導致致敏性降低。加工改變蛋白質高級結構,暴露消化酶作用位點,也會增強過敏原蛋白的消化性,降低過敏原的致敏性。例如,二硫鍵對抵抗酶水解起著重要的作用,二硫鍵被破壞后,蛋白質在人體內的消化性增強,潛在致敏性降低。

加工引起的蛋白質結構變化除了可以直接影響致敏性之外,聚集性,消化吸收性等其它性質的變化也會間接影響致敏性。通過共價鍵或非共價鍵交聯作用可以改變蛋白質的聚集性,這個過程中可能產生新的免疫反應性結構,增強過敏原的潛在致敏性,也可能因聚集而使得過敏原表位被破壞或者掩蓋進而降低致敏性。消化吸收性的改變也會影響蛋白的致敏性,通過加工若能增強過敏原蛋白的消化吸收性,其致敏性可能會降低,主要是由于消化過程中蛋白被分解為小的片段,過敏原表位被破壞,與抗體的結合能力下降;同時消化也可能暴露出過敏原中包埋的天然表位而增強致敏性。

蛋白質的結構決定其功能,但對于過敏原蛋白,其結構變化和功能(尤其是致敏性)變化之間的規律性聯系還未被闡明,還需要大量的實驗數據來支撐這一規律的探索。揭示加工中花生過敏原蛋白結構的變化與性質之間的規律,將有助于通過加工定向影響花生致敏性,實現低致敏甚至是脫敏花生的生產,降低和消除花生致敏的食品安全風險。

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Alteration in structure of peanut allergens caused by processing and its impact on properties

ZHAO Rui-fang1,2,WU Zhi-hua1,2,LIAN Jun1,2,ZHAN Shao-de1,2,WANG Juan3,YAO Zhi-wen4,CHEN Hong-bing1,2,YUAN Juan-li1,5,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.School of Journalism & Communication,Nanchang University,Nanchang 330031,China;4.Engineering Training Centre,Nanchang Hangkong University,Nanchang 330063,China;5.Institude of Pharmacology Teaching and Research Section,Nanchang University,Nanchang 330006,China)

Peanut is listed among eight major food allergens by Food and Agriculture Organization(FAO). More and more attention had been paid on peanut allergy for its severe allergenic reactions and broadly application. Presented work summarized the relationship between the alteration on structure and properties of peanut allergens after vary processing. Attempt was made to help finding the way changing the properties of allergens directionally by process.

peanut;allergen;structure;allergenicity

2015-06-23

趙瑞芳(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：loverainbowfang@163.com。

*通訊作者:袁娟麗(1976-)，女，博士，講師，研究方向：營養與衛生學，E-mail：chinese582@sohu.com。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)資助(2013AA102205)；江西省青年科學家(井岡之星)培養對象計劃(20142BCB23007)。

TS252.7

A

1002-0306(2015)23-0386-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.072