篩查獻血者丙型肝炎病毒感染研究進展

張佳娟　綜述，李　平　審校

篩查獻血者丙型肝炎病毒感染研究進展

張佳娟綜述，李平審校

【摘要】丙型肝炎病毒（HCV）是一種單股正鏈RNA病毒，全長約9.6 kb，開放讀框區編碼結構蛋白和非結構蛋白。全球HCV感染率約為3%，是一種嚴重威脅人類健康的傳染病，在獻血者中進行HCV篩查是防控丙型肝炎病毒傳播的最有效手段。目前，檢測HCV感染的方法主要包括抗HCV抗體檢測、HCV抗原檢測、HCV抗原-抗體聯合檢測、膠體金法快速檢測、HCV分子核酸檢測等。抗體檢測應用最早，但窗口期較長；抗原檢測能縮短窗口期，敏感性高，但易受到體內因素的干擾而影響檢測結果。一些快速檢測方法不需要任何設備，且簡便易行，但其敏感性較差。分子檢測使用的HCV RNA擴增技術（NAT）是目前最敏感的檢測技術，能大大縮短窗口期，但其檢測成本較為昂貴。各檢測方法各有其優缺點。目前，血液中心采用至少兩種不同試劑檢測抗HCV以進行血液的安全篩查。

【關鍵詞】丙型肝炎病毒；輸血后肝炎；核酸擴增試驗；獻血者

輸血治療是臨床上搶救危重患者的重要手段之一，但在輸血過程中存在傳播疾病的風險。由于我國是病毒性肝炎的高發區，輸血后肝炎（post-transfusion hepatitis，PTH）已成為現代輸血領域的一個突出問題。在所有PTH中，90%都和丙型肝炎病毒（Heptitis C Virus，HCV）感染有關。隨著醫學檢驗的不斷進步，HCV檢測方法已有較大的發展，制定符合經濟成本和安全保障需求的篩查方案，降低輸血感染HCV風險是一項刻不容緩的任務。我國現階段HCV抗體檢測是國家血液篩查的強制標準，膠體金快速檢測可作為初篩檢測，HCV RNA核酸檢測只在部分發達地區的血站試行，而HCV抗原檢測尚未應用于血液篩查。本文就上述幾種HCV檢測技術進行綜述，以加深對其認識。

1　HCV概述

1943年Beeson和Morgan最早報道了部分患者在輸血后出現黃疸［1，2］。黃疸的出現引起學者對輸血后感染以及PTH的重視和研究。乙型肝炎病毒（Heptitis B Virus，HBV）是最早發現和PTH相關的肝炎病毒，1971年美國政府規定在獻血者中篩查乙肝表面抗原（HBsAg）［3］，但此后PTH仍時有發生，而其中大部分（約75%）都和HBV感染無關。1973年Feinstone et al發現了甲型肝炎病毒（Heptitis A Virus，HAV），隨后的研究證明其并不通過輸血感染［4］。1977年柳葉刀雜志上曾報道新的PTH病原體，但當時未能鑒定出是何種肝炎病毒，于是采用非甲非乙肝炎（non-A，non-B Heptitis，NANBH）這個概念［5］。直至1989年美國學者Choo采用分子生物學技術成功克隆了HCVcDNA，鑒定為新型肝炎病毒。HCV可通過輸血感染，是PTH的另一主要病原體［6］。據世界衛生組織統計，全球HCV的感染率約為3%，每年新感染病例約315萬例［7］，死亡25萬例，占所有傳染病死因的第10位。由于HCV RNA的變異性，短期內難以研制出特異性的丙型肝炎疫苗，預防HCV感染主要通過積極有效的措施來切斷傳播途徑。不同國家報道獻血者中HCV陽性率從0.4% 到13.3%不等［8～11］，在獻血者中篩查HCV以防控輸血感染尤為重要。

HCV屬于黃病毒科，其基因組為單股正鏈RNA病毒，全長約9.6 Kb，包括5’非編碼區、開放讀框區和3’非編碼區［12］。開放讀框區編碼長度約3000個氨基酸的蛋白前體，經宿主細胞基因和病毒基因編碼的蛋白酶切割，成熟為結構蛋白和非結構蛋白。HCV基因組的5’端為結構蛋白的結構區，由C、E1和E2基因組成，分別編碼核心蛋白、包膜蛋白gp33 （E1蛋白）和包膜蛋白gp70（E2蛋白）。核心蛋白含190個氨基酸，序列十分保守，在 HCV增殖及致病機制中起重要作用，是HCV感染的重要標志。E2蛋白的氨基端有一個高變區，可能是中和抗體作用的位點。HCV基因組的3’端為編碼功能蛋白的非結構區，分別編碼非結構蛋白NS2、NS3、NS4 和NS5。其中NS3蛋白具有蛋白酶功能，NS5蛋白為RNA依賴的RNA多聚酶，分為NS5A和NS5B。NS3、NS4和NS5均能有效的誘導HCV感染者出現抗體應答，其中NS3抗體出現最早，但由于其是構象依賴性的，使用NS3的合成多肽并不能檢出相應的特異性抗體。而NS4區則含有至少兩個免疫優勢序列位點，抗原性較強，絕大多數HCV感染者能產生針對該區C100-3的抗體反應［13］。

2　血清HCV抗體檢測

HCV抗體檢測主要采用酶免疫分析（EIA）技術，先后已經歷了三代技術發展。不同HCV抗體檢測試劑分別針對HCV不同結構蛋白的不同表位而設計，1989年美國Chiron公司最早利用重組HCV抗原C100-3融合蛋白包被，建立了第一代HCV抗體檢測方法。第一代方法通常在感染HCV 后12 w～26 w才能檢測出抗體，存在一個較長的窗口期［14］。同時第一代方法只是根據非編碼抗原NS4區域進行設計，其特異性差、靈敏度也較低。第二代HCV抗體檢測試劑盒于1990年出現，它以HCV基因組非編碼抗原NS3區的C33C 和NS4區的融合表達抗原（C200）再加上C區的核心抗原C22-3作為固相包被進行檢測。第二代檢測方法彌補了第一代方法的部分不足，提高了HCV檢測的敏感性和特異性。研究顯示，其在HCV感染高危人群中的檢出率較第一代檢測方法提高了5%～40%；在急性輸血后HCV中，較第一代方法提高20%以上；而在慢性HCV感染者中的檢出率也增加了10%以上；同時抗C33C較抗C100-3出現早30天～90天，可縮短窗口期至10周左右［15］。目前國內獻血中心采用的HCV篩查方法，絕大部分用的都是第三代HCV抗體檢測方法。第三代方法在第二代的基礎上，還結合了另一個非編碼抗原NS5，由于同時檢測病毒基因組的結構區和非結構區的多個編碼抗原，不但提高了檢測的靈敏度和特異性，還使檢測的窗口期又縮短了1周左右［16］。EIA檢測抗體技術具有簡便、快捷等特點，但易受到諸多因素的影響，如類風濕因子、高免疫球蛋白血癥、標本中超氧化物歧化酶等因素可造成假陽性結果；而檢測過程中加樣時間過長、操作速度過快、洗板等因素可造成假陽性結果［17］。由于HCV感染到機體抗體產生有一個較長的時期，平均約40天～70天，稱為感染后血清轉陽前的窗口期。盡管第三代檢測技術已將窗口期縮短至66天左右，但這仍然是威脅輸血安全的重要因素之一。

3　血清HCV抗原檢測

核心抗原蛋白（Core）的氨基酸序列在不同基因型的HCV氨基酸序列同源性超過95%，是HCV早期感染的重要標志。目前HCV抗原檢測試劑盒主要檢測HCV的核心抗原，對HCV核心抗原檢測有利于HCV早期感染獻血者的發現，特別是一些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者及某些不產生抗體的攜帶者。一項對18例HCV抗體陰性，HCV RNA陽性的患者研究發現，11人（61%）能夠檢測出HCV核心抗原陽性［18］。另一項研究發現6名HCV RNA陽性，HCV抗體陰性的獻血者中，5例（83%）的獻血者為HCV核心抗原陽性；在135例長期血液透析患者的血清標本中，有92例HCV RNA陽性，其中81例（88%）檢測出核心抗原陽性［19］。目前認為HCV核心抗原檢出的平均窗口期為49天，僅僅比HCV RNA晚1天～2天。HCV核心抗原陽性與HCV RNA檢測結果之間存在一定的相關性，國內一項研究報道：在142例慢性丙型肝炎患者血清中，HCV核心抗原和HCV RNA陽性率分別為45.1%和43.0%，兩種標志物均為陽性者58例，均為陰性者75例；HCV RNA陰性血清HCV核心抗原陽性6例，HCV RNA陽性血清HCV核心抗原陰性3例，結果符合率為93.7%（133/142），核心抗原檢測和病毒檢測的陽性率無統計學差異（P＞0.05）［20］。一項薈萃25篇文章的meta分析結果顯示：HCV核心抗原檢測的敏感性平均約84%（95%CI：0.83-0.85），而特異性可達到98%（95%CI：0.97-0.98）［21］。HCV抗原檢測耗時短，方法與常規酶免疫實驗相似，不用添加儀器設備，且大大縮短了窗口期。但是當機體出現HCV抗體之后，體內HCV核心抗原和抗體相結合，抗原檢出率下降。因此，HCV核心抗原主要應用與HCV感染的早期診斷［22］。

4　血清HCV抗原-抗體聯合檢測

HCV抗原-抗體（HCV Ag/Ab）聯合檢測被認為是“第四代”檢測技術，近年國內外已有多篇文獻報道使用。該方法主要應用夾心酶免疫技術，在固相和第二層中包被了HCV衍生抗原和HCV抗體。Laperche et al［23］采用Monolisa HCV Ag/Ab聯合檢測對12份HCV RNA和HCV抗原檢測均陽性、HCV抗體檢測陰性的樣本進行檢測，其中有6份樣本檢測結果呈陽性。他們還對發生HCV抗體陽轉的血液透析患者血清標本進行動態研究，在抗體陽轉前采集的樣本中，24 份HCV RNA陰性的樣本Monolisa HCV Ag/Ab聯合檢測亦呈陰性，59份HCV RNA陽性的樣本中有23份呈陽性；對于血清HCV抗體陽轉后采集的83份樣本中，Monolisa HCV Ag/Ab聯合檢測結果均呈陽性。Laperche et al隨后對44份核酸檢測呈陽性的窗口期標本進行檢測，其中31（70.5%）能夠使用Monolisa HCV Ag/Ab檢測呈陽性。Monolisa HCVAg/Ab聯合檢測的窗口期平均為26.8天，平均比核酸檢測晚5.1天，而聯合檢測的特異性能達到99.88%［24］。另一種聯合檢測試劑Murex HCV Ag/Ab同樣具有較高的靈敏度和特異性，報道稱其窗口期比HCV抗體檢測方法早14.1天，更比Monolisa HCV Ag/Ab方法早2天左右［25］。

5　快速檢測

膠體金法快速檢測技術從1989年誕生至今，已被廣泛應用于免疫檢測的各個領域，這個方法可以在幾分鐘內完成檢測，并且不需要依賴任何儀器和設備。HCV膠體金法快速檢測技術主要采用特異性抗原抗體反應及免疫層析技術，對HCV的Core和NS3抗原進行標記和包被制備檢測試劑。HCV不同來源的診斷抗原、抗原濃度比例和制備工藝都可能影響試劑的檢測性能［26］。樣本溶血會影響膠體金在硝基纖維膜上的層析過程而出現假陰性；非特異性的高IgG對固相載體具有較強的吸附力，可引起假陽性［27］。來自51個血液中心的檢測結果顯示：快速HCV抗體檢測的敏感性范圍是47% ～100%［28］。雖然臨床使用中存在一定的假陽性和假陰性，但膠體金法快速檢測仍可作為篩查HCV抗體的首推方法，對于早期發現預防和控制丙型肝炎具有重要的臨床價值和應用［29］。

6　HCV分子核酸檢測

HCV感染后基因組的復制出現較早，感染后數天即出現病毒血癥，大約1～2周即可檢測到HCV RNA。HCV RNA是HCV在機體內存在的最直接標志，對其檢測可大大縮短窗口期。核酸擴增試驗（nucleic acid amplification，NAT）是一系列直接檢測病原體核酸的技術的總稱，主要是使用一些物理、化學和生物學的方法，通過靶核酸擴增的方法，將極微量的核酸轉變成直觀的光電或可視信號，從而判斷是否存在病原體［30］。NAT檢測技術主要采用聚合酶鏈反應（PCR）和轉錄介導的擴增（TMA）兩種原理。PCR過程需要先將RNA逆轉錄（RT）為cDNA，再進行DNA擴增；而TMA利用T7RNA聚合酶進行一系列反應，在等溫條件下進行反轉錄以提高RNA水平到可檢測的程度。NAT可檢測出極微量的核酸，大大縮短窗口期，目前已有40多個國家的血液中心開始使用NAT技術在獻血者中檢測HCV，我國也逐步將NAT血液篩查納入新的輸血技術操作規程［31］。最初的NAT檢測方法是混合樣品檢測（MP-NAT），即混合6-96個標本同時進行檢測［32］，但是MP-NAT在降低成本的同時也大大降低了檢測的敏感性，部分發達國家的血液中心開展單份樣品檢測（ID-NAT）以提高HCV檢測的敏感性［33］。

NAT方法靈敏度可檢測出載量為2.0IU/ml～9.4IU/ml水平的HCV RNA［34］，同時可縮短窗口期至4天～6天，此外，它還可以檢測出免疫靜止期攜帶者體內的病毒。當NAT篩查方法用于輸血前篩查后，輸血感染HCV的風險進一步顯著下降。美國于1999年開始使用NAT技術在獻血者中篩查HCV，在此之后的10年間6600萬HCV抗體陰性的獻血者中，NAT檢測方法共篩查出244例獻血者HCV陽性，與1999年相比，2008年的獻血者中HCV流行率下降了53%［35］。德國在1990年至1998年間，每年大約有7起輸血感染HCV病例發生，但在使用NAT檢測后，幾乎沒有新增病例的報道［36］。NAT技術以其高敏感性和特異性已得到廣泛應用，但是仍存在一些抗體陽性，NAT檢測陰性的報道，國內有學者對47004份無償獻血者標本進行檢測比較，ELISA檢測到的HCV抗體陽性樣本總數共245份，而NAT檢測HCV RNA陽性結果為12份，最終確定15份為HCV陽性［37］。另外，NAT技術對儀器、設備以及人員培訓均有較高的要求，在部分欠發達國家和地區推廣使用受到限制。

7　結語

臨床輸血的風險最小化和利益最大化需要血液中心提供充足和安全的血液，“零容忍”是人們對輸血風險的態度。隨著檢測技術的發展，輸血風險不斷降低，但各檢測試劑仍有其優缺點，尚不能以某一種方法代替其他方法。ELISA抗體檢測雖然價格便宜，但窗口期較長；HCV核心抗原檢測操作易行，敏感性高，費用低廉，但易受到體內抗體的影響。快速檢測簡便、易行，但其敏感性較差。NAT檢測在現階段提供了最安全的保障，但其昂貴的價格制約了全面推廣。因此，各檢查技術應相互結合，發揮各自的優勢，以降低輸血感染HCV的風險，保障血液安全。

我國從1998年開始在獻血者中全面采用兩種試劑檢測HCV抗體，但單純抗體檢測存在一定的假陰性和假陽性。最新的《血站技術操作規程（2012版）》建議：采用2個不同生產廠家的ELISA試劑檢測HCV抗體或聯合檢測HCV抗原和抗體；或者采用1種ELISA試劑檢測HCV抗體或聯合檢測HCV抗原和抗體，采用1種試劑檢測HCV核酸。我國目前仍處于發展中國家，各地區應根據經濟發展特點，結合獻血人群HCV流行病學分布，調整HCV篩查策略，制定安全可靠、符合經濟成本的血液篩查方案。

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（收稿：2014-05-23）

（本文編輯：張駿飛）

第一作者：張佳娟 ，女，32歲，大學專科，護師。主要從事血液檢驗和采集工作。E-mail：leep2002@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.031

作者單位210003南京市 紅十字血液中心（張佳娟）；解放軍第81醫院（李平）

Screening tests for hepatitis C virus infection in blood donors:does it safe or not？ Zhang Jiajuan，Li Ping.Department of Physical examination and Blood Branch，Blood Center，Red Cross，Nanjing 210003，China

【Abstract】Hepatitis C virus（HCV）is a single-stranded RNA virus that is about 9.6 kb.Its open reading frames encoding structural proteins and non-structural proteins.HCV infection is approximately 3%worldwide.It is one of the most serious infection diseases that threaten human health.Screening tests in blood donors is the most effective means to prevent the communication of HCV.The current methods for screening tests include detection of HCV antigen，anti-HCV antibody，HCV antigen-antibody complex，and HCV genes.Antigen detection is the initial screening test and it detects seroconversion after a long infectious window period.The detection of HCV core antigen might shorten the window period and has a high sensitivity，but interference by immunoglobulins in vivo influence its widespread uses.Rapid tests is simple to perform，but its sensitivity is low.Molecular testing for HCV RNA utilizing nucleic acid amplification technology（NAT）is the most sensitive assay and can shorten the window period，while the costs is very expensive.Each screening tests for HCV infection has its advantages and disadvantages.Currently，the blood centers are using at least two different reagents to detect HCV antibodies for blood screening.

【Key words】Hepatitis C virus；Post-transfusion hepatitis；nucleic acid amplification technology；Blood donors