臨床實驗室-急性早幼粒細胞白血病早期救治中的重要參與者

肖作淼綜述，王小中審校

(1、贛州市人民醫院檢驗科，江西 贛州341000；2、南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006)

急性早幼粒細胞白血病 (acute promyelocytic leukemia,APL)俗稱M3,因發病急、病情進展快，容易合并DIC繼發腦出血而視為內科中的急癥[1-8]。該病由特異性染色體易位即t(15;17)(q24.1;q21.1)導致早幼粒細胞異常增殖并分化障礙致機體發病。隨著全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)和三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)的應用，使APL從高致死性疾病發展成為高治愈性的一類髓系白血病[7-12]。目前APL患者死亡主要發生在就診30天內即早期死亡(early death，ED)[7-10]，該時期也成了患者的最危險時期，ED主要與患者未及時就診或就診后未及時得到確診與專業救治有關[2,9,11,13]。因此，實驗室在早發現早診斷過程中成為APL救治成功的重要因素，有著積極的的作用[14-18]，現就APL實驗室診斷的傳統與新興手段作一綜述。

1 外周血象和外周血形態檢查

APL 患者發病會引起血象改變，血小板計數(BPC)大多數減少[4,16,19]，伴有血紅蛋白(Hb)減低和(或)白細胞(WBC)數改變，因此患者血象多表現為三系、二系減少，或血小板減少伴WBC增高，單獨血小板減少者少見。WBC和BPC數也是APL分層治療與預后的重要指標[4,10,12,14]，WBC<10×109/L,BPC>40×109/L 為低危組， WBC<10×109/L,BPC<40×109/L為中危組，而WBC>10×109/L則劃分為高危組。因APL發病時臨床癥狀不同，患者就診科室不同，但大多數患者就診時都會查血象，也是涉及病源最廣的項目，因此臨床實驗室有必要對上述血象改變者進行外周血形態篩查。在血片中大多能檢見顆粒增多的異常早幼粒細胞或同時檢見柴捆狀細胞 (faggot cell)，這對APL診斷有重要指導意義，亦可作為臨床即刻使用ATRA治療的重要依據，故臨床實驗室有必要將其視為“危急值”報告臨床醫生。對可疑APL血象者進一步行形態學檢查通?？傻玫街匾€索，而且最快半小時內(通常1小時內)出報告，所以是實用價值很高的篩查手段，成為APL救治的第一道重要關口。

2 骨髓形態學檢查(mo r p h o l o g y，M)

骨髓形態學檢查是WHO白血病MIMC分型(Morphology、Immunology、Cytogenetics 和 Molecular，MICM)的基礎，是診斷 APL 的傳統方法[2,15,18,20]，骨髓片自然干燥經瑞(Wright)氏或瑞-吉(Wright-Giemsa)氏染色后分類計數500個有核細胞，APL患者骨髓中異常早幼粒細胞增多，此類特征性異常早幼粒細胞≥30%(NEC計數)即達到APL之英法美(French-America-British,FAB)診斷標準[21]。 根據顆粒多少及粗細，FAB分型分為M3和M3v，而國內通常分為：①粗顆粒型 (M3a)②細顆粒型(M3b)。粗顆粒型(M3a)相當于FAB分型中的M3為經典型APL；而細顆粒型(M3b)相當于M3v則為變異型APL，約占20%，主要見于WBC增高的高危組。除顆粒增多的異常早幼粒外，部分APL患者同時可見大量奧氏小體(Auer rod)的柴捆細胞[3,20,22],檢見此類細胞有助于APL的診斷。骨髓形態診斷為APL者應盡快使用ATRA以減少出血風險[2,7,9,16,20]，故實驗室應立即聯系臨床，以便及時按APL來救治患者。但約有15%~20%APL形態不典型[15,19]，需要仔細鑒別才能找到典型形態的APL細胞,要求工作人員有較豐富的骨髓形態學經驗以及足夠的耐心,若能結合組化染色如過氧化物酶(POX)和特異性酯酶(SE)染色則能有效地與M5b鑒別。為提高APL的救治成功率，骨髓報告有必要執行分級報告制度，即2h內電話初步報告和24h內正式報告相結合的模式，從而為早期救治贏取時間。骨髓形態學檢查最快能在1h內得出骨髓像信息，且大多數APL形態學檢查能夠確診，最大的優勢在于方便、快捷和低廉，是APL診斷的最快速和最基本的檢測方法，在APL早期救治中發揮著極其重要的作用。

3 免疫學檢查(i mmu n o l o g y，I)

應用流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢查技術，加入單克隆抗體標記分析骨髓細胞。因APL擁有顆粒增多的異常早幼粒細胞，其圖形側向散光(SSC)增大，擁有較獨特的免疫表型[2,3,15,18]，且不受染色體隱匿易位影響,最快能當天(通常為2d)出報告,與形態學檢查結合能有效提高APL的診斷效率與正確率。APL最典型的表型多為CD34-HLA-DRCD13+、CD33+、CD117+, 但不屬于特異性表型[3,15,17]，因為以上表型亦見于非APL的其他AML。有研究者嘗試不同單抗組合將AML中APL與非APL區分開業，如Zhou聯合CD11a和CD18區別于其他類型的AML[3]，其敏感性為83%，特異性達到79%；Dong等聯合CD11b和CD11c為特異性達95.3%，敏感性達96.2%[15]。針對APL免疫表型不同與形態學、分子生物學分型及其預后的相關研究也越來越多[3,9,14,18]，如表達 CD2+、CD34+、CD56+提示預后不良，多見于 M3v(或 M3b)，PML/RARa融合基因多為BCR3(S型)。免疫學檢查主要缺點是設備昂貴，檢測費用高，隨著FCM儀器的普及，其在APL的早期救治中發揮著越來越重要的作用，成為診斷APL的重要輔助手段，但目前尚不屬于APL確診方法。

4 細胞遺傳學檢查(c y t o g e n e t i c，C)

4.1 染色體核型(karotype)把骨髓細胞接種于RPMI1640培養液進行24~48h培養后，收獲并制備染色體標本通過顯帶進行核型分析 染色體顯帶技術主要有G顯帶和R顯帶技術，前者最為常用，其染色體的帶紋較多且細致，有較強大的解象力容易查出更多細微變化。而R帶方法操作簡便重復性好帶型清晰，其顯帶成功率明顯高于G帶，對提示染色體末端的缺失和易位特別有價值，而血液病涉及染色體末端異常者較多，故在血液病核型分析應用中也越來越普遍。APL具有獨特的染色體核型，其經典核型通常為t(15；17)(q24；q21)[10,20,23]，其他變異核型少于 2%[5],如 t(11；17)(q23；q21)，t(5;17)(q22；q21)t(11；17)(q12；q21)等,t(11；17)(q23;q21)對 ATRA 治療無效。此外，t(15；17)伴隨附加異常有20%~30%的檢出率，但其預后與單純t(15;17)相比并無統計學差異[16,19,24]。染色體核型是APL確診方法之一[2,3,9,19]，主要不足是操作復雜，出報告時間長(通常7~14d)，干擾因素多使染色體培養或核型分析失敗，顯然不利于APL的早期救治。

4.2 熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫熒光染色 FISH方法對骨髓或外周血標本處理簡單，無細胞培養要求，雜交和檢測效率高，敏感性和特異性高，能同時檢測中期和間期細胞的基因融合信號，應用FISH軟件分析技術，可以直觀地觀察到融合信號，是細胞遺傳學的重要補充手段，尤其是染色體培養失敗或核型正常，但臨床高度懷疑為隱匿易位時意義更大[21]。應用FISH檢查PML/RARa融合基因，是一個簡便而快速(最快當天發報告，通常為2d)的檢測方法[8]，能使APL快速得到確診，有利于APL早期救治。但FISH也存在一定的局限性：熒光顯微鏡昂貴、一個探針(probe)只能檢測一種融合基因、只能固定檢測目標基因，如要檢測變異融合基因PLZF-RARa、NUM-RARa則要使用多個探針。因成本高，費用貴,在國內的臨床應用中受到一定限制[25]，未能將FISH方法中簡便而快速的優勢應用于APL早期救治，而更多使用在染色體培養效果不佳或核型分析有疑問需要驗證的情形。Rego應用免疫熒光染色技術對130例APL可疑者的抗-PML進行快速診斷(平均4h內報告)[9]，結果與PCR檢測PML/RARa或染色體培養結果一致，所以抗-PML免疫熒光染色法對APL早期確診有著重要意義，但目前在國內應用并不普遍。

5 分子生物學檢查(mo l e c u l a r，M)

應用實時定量PCR (real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RQRT-PCR)技術分析技術檢測PML-RARa轉錄本。PML-RARa融合基因通常有三種類型，由不同的斷裂點所造成，6號內含子處為bcr1(L型)；6號外顯子處的bcr2(V型)，及位于3號內含子的bcr3(S型)，其中bcr1斷裂處最多約占55%，bcr3其次約占40%，bcr2最少約占5%[1,16]。PCR方法在核型正常的隱匿易位中同樣可檢出PML-RARa及變異異位如PLZF-RARa、NUM-RARa轉錄本，因其敏感性高(可達10-4個細胞)、費用相對較低，但相對與形態和流式檢查而言技術要求較高、操作較繁雜(需要將提取的RNA逆轉成cDNA)、更費時，通常在3d內可出報告，是國內確診APL應用最為廣泛的項目[1,9,10,16,27]，同時也是微小殘留(minimal residual disease,MRD)監測中常用手段，在APL確診與監測中發揮重要作用。

APL的早期死亡與出血并發癥息息相關，在ATRA應用前，出血相關的早期病死率(early death rate，EDR)高達 60%[7,10]。 進入 ATRA 應用時代，多個協作組EDR報道為5%~10%[6,8,11]，但反對者的文獻報道為10%~30%不等[6,9,13,26-28]，認為ATRA的使用并未能有效地降低早期死亡率，許多APL的死亡者在入組研究前已經死亡。死亡原因包括患者未及時就診或者醫院未及時明確診斷或ATRA使用過慢，導致ATRA還未能充分發揮誘導分化功能時，患者往往已繼發了DIC并發腦出血，這是最大的死亡原因。目前，國內外專家達成共識：對形態學檢查或臨床癥狀上懷疑為APL的患者應使用ATRA[2,6,7,19,27]這是降低EDR有效的途徑，待遺傳學和分子生物學檢查確診者繼續使用ATRA到完全緩解，而對于不支持者則停用ATRA臨床處理方法其利大于弊。

APL屬于危急病種[29]，明確診斷的時限需求應該以小時而非天來計算[1]，盡早對APL患者采取救治措施如使用ATRA、輸血小板、冷沉淀是減低EDR的有效方法，因此實驗室對APL早發現早診斷扮演著重要的角色。FISH或RT-PCR檢測PMLRARa融合基因(轉錄本)和染色體核型分析是APL確診的金標準，但三種手段時間長、費用高，在早發現和早診斷APL的實際工作中有所限制。骨髓形態學檢查能夠快速而準確地識別出絕大多數APL患者，是第一時間能確診APL的檢查手段，尤其對于臨床上懷疑APL(包括外周血形態懷疑，或外周血WBC過低形態不確定者)，骨髓形態都能提供重要的診斷信息。而對骨髓形態不好確定的變異型(M3v)診斷，應用FCM手段能快速地得出免疫表型結果，且APL具有特征性免疫表型，所以形態與FCM聯合能確?？焖偾覝蚀_地完成APL的診斷，為臨床救治APL的提供重要依據，為進一步降低APL早期死亡率(EDR)創造條件。RT-PCR方法檢測PML-RARa融合基因，能較短時間出報告為后續治療(如蒽環類化療藥物的使用)提供依據，是臨床上確診APL最常用的方法。而血象分析是患者就診后接受的第一項檢查，大多患者發病時血象會改變，且絕大多數患者的外周血中能發現APL特征性早幼粒細胞如梁建英報道檢出率為85.8%[19]，故對符合APL血象改變的標本進行涂片篩查是簡單有效的方法，能為臨床診斷APL提供重要的導向,尤其對出血癥狀或凝血檢查項目改變不明顯，或就診于非血液科的患者能提供重要的診斷方向作用。但目前狀況不容樂觀，因為從事血分析的工作人員大多為年輕執業者，他們對形態學檢查普遍經驗缺乏[30,31]，對APL的危急程度亦認知不夠，使外周血形態在APL篩查中的作用力下降，應當引起行業的警惕。

總之，APL屬急癥，其救治要求多科室、多學科的互相協作，而早發現早診斷的過程中臨床實驗室發揮積極的作用，是APL救治中的重要參與者。

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