常用染色體分析技術在產前診斷中的應用

黃寧綜述，劉艷秋審校

(江西省婦幼保健院產前診斷中心，江西 南昌 330006)

產前診斷學是一個正迅速發展，技術不斷完善的新領域，對提高人口素質，實行優生優育具有重要意義。染色體分析是產前診斷中一項重要的常用檢測手段，如何對細小的染色體異常做出準確的核型分析一直是困擾產前診斷技術人員的技術難題之一。隨著技術的不斷發展，染色體分析方法已在傳統的顯帶核型分析的基礎上，開發了熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)，比較基因組分析 (comparative genomic hybridization，CGH)、光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)。

1 常規顯帶核型分析及應用

自20世紀70年代以來染色體顯帶核型分析一直是產前細胞遺傳學診斷染色體病的標準方法，中期染色體標本經特殊處理后，能顯現出著色深淺不同的橫紋，通過常規的核型分析技術我們可以檢測出許多染色體數目和結構異常[1]。常用的顯帶方法有 G、R、C、Q、N、T等分帶方法。 以 G 顯帶最為常見，可以檢出300~1000條帶階段染色體的結構異常，R顯帶與G顯帶條紋正好相反，有利于顯示染色體末端缺失、重排。但在許多復雜的病例如染色體微小結構易位、非平衡易位、環形染色體、微小片段的插入、標記染色體和復雜的結構異常，通過傳統的染色體顯帶核型往往不能發現或難以準確定位異常染色體的片段來源，對于復雜異常染色體的診斷常常比較困難。

2 F I S H及應用

FISH是一門新興的分子遺傳學技術，是20世紀80年代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術。現已廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。其技術原理是用已知的標記單鏈核酸為探針，與待檢染色體中單鏈核酸按照堿基互補原則進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，從而將特定基因在染色體上定位。FISH技術靈敏度及特異性高，能檢測染色體微小缺失及重排，標本來源豐富，間期細胞、分裂中期細胞、分化或未分化細胞及死亡細胞皆可以被檢測，且能迅速得到結果[2]。但FISH技術依賴于已知的染色體異常，對通過G顯帶技術初步分析但不能確診的異常染色體有重要應用價值。同時FISH只能檢測一個或少數幾個染色體異常，對染色體的增加比較敏感，而對染色體的缺失不甚敏感，當缺乏復雜標記染色體探針時，就難以對未知的異常染色體進行核型分析。Tepperberg等[3]對5348例有產前診斷指征的孕婦選用13、18、21、X染色體特異性探針進行未培養的羊水間期細胞分析，并與羊水中期細胞培養結果進行對照。FISH分析成功的5197例，占總數的97.2%，與中期羊水染色體細胞培養結果一致率為99.8%。對所有發現的非整倍體，FISH的敏感性為99.6%，特異性99.9%。羊水細胞培養染色體分析聯合FISH技術快速、靈敏度較高、特異性較強，對于非整倍體產前診斷具有重要意義。

3 C G H及應用

CGH技術是在FISH 基礎上結合消減雜交技術發展起來的一種新的分子細胞遺傳學技術，該技術利用兩種不同的熒光分別標記待檢組織基因組DNA和正常組織基因組DNA，再同時與正常淋巴細胞中期染色體進行雜交的過程，借由此比較染色體上不同熒光間的強弱比值，來檢測基因組中特定基因的拷貝數變異。它通過單一的一次雜交可對整個基因組的染色體拷貝數量的變化進行檢查，還能確定一些常規顯帶法已發現的異常染色體定位。可用于檢測組織DNA異常如缺失、擴增、復制，并在染色體上定位。CGH能全面觀察染色體獲得缺失情況，了解染色體臂或區帶的增加或缺失[4,5]。其缺點是只能檢測待檢基因組中相對正常基因組平均拷貝數的變化，而不能檢測易位、倒位及其他拷貝數沒有變化的染色體異常，對微小的重復、缺失檢測不出。陽鑫妙等[6]對1例5條染色體發生復雜易位的胎兒作出產前診斷，羊水細胞染色體結果為46,XX,t(5;7;12),t(14;21)，夫妻雙方外周血染色體核型正常，應用array-CGH技術對羊水細胞進行全基因組高分辨掃描分析，了解是否有微小缺失和重復，結果顯示胎兒染色體未發生微缺失或微重復，結論提示array-CGH技術與傳統細胞學技術相結合，可大大提升產前診斷技術水平。

4 S K Y及應用

1996年Schrock[7]等在FISH的基礎上開發出SKY技術，SKY技術應用不同熒光素標記的24種全染色體涂染探針，與中期染色體進行原位雜交，使發射光譜的所有信息用于分析。這種全染色體著色技術僅需一次熒光標記雜交，一次影像攝取，一次分析，即可使每條染色體都清楚地按照不同的著色呈現出來，其分辨率達1.5MB大小[8]，能準確識別常規染色體顯帶法和FISH技術難以發現的染色體異常。為復雜的染色體結構異常，來源不明的標記染色體的診斷提供了可能。但SKY技術不能識別同一條染色體內部結構異常，如倒位，缺失或重復片段的定位[9]。Yaron等[10]用SKY技術評估5例高齡產婦中額外的異常結構染色體(ESACs)，發現用SKY技術診斷非隨體和環形染色體的異常結構染色體十分有效。

5 展望

傳統的染色體顯帶核型分析一直是細胞遺傳學染色體分析的金標準，具有不可替代的優勢，應用G顯帶可以對受檢人群進行全面染色體分析，檢測46條染色體的數目異常、染色體平衡或非平衡易位、倒位等明顯的結構異常[11,12]。相繼開發出的各種分子遺傳學技術實驗周期短，同時具備更高的分辨率。FISH技術作為一項快速染色體檢測技術，可以對常見的非整倍體染色體異常作出快速檢測，正常的檢驗結果可以在1~2d內即可得到[2,13]，可以有效緩解孕婦緊張情緒。部分學者認為如產前診斷指征為唐氏篩查高危人群或高齡孕婦，FISH可以有效地取代核型分析，但另一些學者認為一部分有臨床意義的染色體異常病例會被遺漏[14-17]，此外還存在一些FISH檢測與核型分析不一致的結果[18]。額外小標記染色體是通過常規核型分析可以發現，但不能確定其來源的染色體片段，必須借助其他檢測技術進行明確診斷，如aCGH、SKY[19,20]。aCGH和SKY技術作為一種新型的細胞遺傳技術，克服了傳統顯帶核型分析技術的缺點和FISH技術的局限，使得額外小標記染色體和染色體微小片段的插入、缺失及由此衍生的復雜結構異常的檢測成為了可能，大大提高了產前診斷的精確度和效率[21,22]，但同時也存在一些局限性，應與其他技術結合應用[9,23]。筆者認為，在產前診斷領域，聯合應用顯帶核型分析和FISH技術對高危孕婦人群進行檢測，可以滿足大部分臨床需要；而對于顯帶技術不能確定來源的標記染色體，插入片段，微小的異常染色體結構及復雜的染色體畸變，則應用SKY技術或CGH技術一目了然，再針對異常區域設計特定探針用FISH技術進一步確認，可使產前診斷的核型確診率和疑難核型診斷率得到提高[24,25]。隨著分子遺傳學技術的快速發展，產前診斷中越來越多的傳統核型分析無法診斷、解釋的病例得到了明確診斷，細胞遺傳學技術和分子遺傳學技術的結合、合理運用，無疑將開拓臨床應用領域。

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