馬鈴薯StPYL1 和StPYL8 基因的分子克隆與表達分析

徐玉偉， 印敬明， 白 瀟， 史 珂， 楊 清

(南京農業大學生命科學學院，江蘇 南京210095)

植物激素脫落酸(Abscisic acid，ABA)參與了多個植物生長發育過程，如促進葉、花、果脫落，側芽生長，塊莖休眠以及葉片衰老，抑制種子發芽，植株生長等［1］。作為“脅迫激素”，ABA 在植物應對生物脅迫與非生物脅迫過程中也起著關鍵作用［2-3］。在干旱和高鹽脅迫下，植物體內ABA 的含量迅速增加，調節氣孔關閉，減少蒸騰，保護光合作用，并調控大量相關基因的表達［4-5］。

ABA 信號轉導是一個復雜的生物學過程，ABA 受體是ABA 信號通路最上游的信號調節因子，承擔著識別ABA 信號和啟動信號轉導原初過程的使命［6］。在過去的研究中，一共發現了4 種ABA 受體，最先報道的是從蠶豆和擬南芥中分離的葉綠體蛋白ABAR/CHLH，該蛋白既是ABA 的受體(ABAR)，同時也是鎂螯合酶H 亞基(CHLH)，參與葉綠素的合成和質體-核反向信號傳導［7-8］。WRKY 類轉錄因子負調控ABA 信號，它能夠抑制ABI5 等響應ABA 的基因在細胞中正常表達［9］。ABAR 通過下調WRKY 類轉錄因子的表達，消除其對ABI5 等基因的抑制作用，向下釋放ABA 信號，但缺少其能與ABA 直接結合的結構證據［10］。第二種G 蛋白偶聯受體GCR2，GCR2 是ABA 在細胞膜上的一種受體［11］。對將該蛋白定義為G 蛋白偶聯受體及它在種子發芽和幼苗形態建成過程ABA 信號轉導中的作用一直存有爭議［1］。第三種G 蛋白偶聯受體GTG1 和GTG2，是位于細胞膜上的一類ABA 受體，最近的藥理學和遺傳學證據表明GTG1 和GTG2 確實參與了ABA 信號轉導［12］。盡管上述三種蛋白都被認為是ABA 受體，并在ABA 信號轉導過程中起著重要作用，但是它們在生理和分子上與重要的信號轉導因子如PP2C 和SnRK2 等之間的聯系是不清楚的。2009年，Ma 和Park 兩個獨立的研究小組分別利用酵母雙雜交和篩選突變體方法在擬南芥中篩選出一種新的ABA受體 PYR/PYLs/RCARs (Pyrabactin Resistance/Pyrabactin Resistance Likes，PYR/ PYLs，Regulatory Components of ABA Receptors，RCARs，后 面 統 稱PYLs)蛋白［13-14］。在這種新發現的ABA 信號轉導途徑中有3 種核心組份:ABA 受體PYLs 蛋白、負調控因子2C 類蛋白磷酸酶PP2Cs(Type 2C protein phosphatases)和正調控因子SNF1 相關的蛋白激酶2 SnRK2s (Subfamily 2 of SNF1-related kinases)，三者共同組成了一個雙重負調控系統［13-15］。PYL 是一類含有START(STAR-RELATED LIPID-TRANSFER)特征區域的蛋白質，并且具有此結構域的蛋白質都含有疏水性的配體結合區，并通過該區域與ABA 結合。PYL 與ABA 結合后可抑制PP2C 活性，以阻止PP2C 脫去SnRK2 上的磷酸基團［16-18］。然后，有活性的SnRK2 可磷酸化下游轉錄因子，如ABFs/AREBs 等，通過它們進一步激活ABA應答基因［19-20］。在擬南芥中PYL 蛋白家族有14 個成員，被命名為PYR1 和PYL1 ～PYL13，它們廣泛地分布于細胞質和細胞核內。PYL 可以直接與ABA 結合，但是每個PYL 家族成員與ABA 結合的能力以及對ABA 立體構型的選擇性卻不完全相同［21］。

目前，對PYL 的研究主要集中在擬南芥、大豆等有限的幾種植物及其結構特征上［13-15，18，22］，在馬鈴薯上鮮有相關報道。本研究根據擬南芥與大豆PYL 序列信息及馬鈴薯基因組數據庫信息設計引物，從馬鈴薯栽培品種Désirée 幼苗葉片中克隆PYL 基因cDNA，分析該基因的結構特征、親源關系以及在外源ABA 處理及兩種逆境下的表達模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)栽培品種Désirée，由南京農業大學生命科學學院植物分子生物學實驗室保存。

Trizol 試劑、PCR 相關試劑、M-MLV 反轉錄試劑盒、DNaseI 試劑盒及克隆載體pMD-19T 均購自TaKaRa 公司;凝膠回收試劑盒購自Axygen 公司;引物合成由上海英駿生物技術有限公司完成;大腸桿菌DH5a 為本實驗室保存。

1.2 基因克隆

首先采用Trizol 法從組培苗中提取總RNA，參照DNaseI 試劑盒說明消除微量DNA 污染，用反轉錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA 第1 鏈，作為后續PCR 擴增模板。然后根據已有擬南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(Glycine max)PYL 基因序列，及馬鈴薯基因組數據庫，分別設計出擴增StPYL1 和StPYL8 cDNA 全長序列引物:StPYL1-F(5'-CCTTCCTCTCTCTATTTCTT-3')、StPYL1-R (5'-TCACCTGTGACTTACATCAC-3')、StPYL8-F(5'-GGTTAAAAAGTTGGAAATTT-3')和StPYL8-R(5'-ACAGGATACACCATACACGC-3')，進行PCR 擴增，擴增程序為:94℃5 min;94 ℃40 s，50 ℃30 s，72 ℃50 s，30 個循環;72 ℃10 min。PCR 產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，按凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段，然后將其連接到pMD19-T 載體，熱激法轉化大腸桿菌DH5a，經藍白斑篩選和PCR 檢測，陽性克隆送華大基因公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

序列同源性比對由NCBI 的BLAST 程序(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/blast/)進行。開放閱讀框架預測由NCBI 的ORF finder (http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)程序完成。蛋白質一級結構(等電點、分子量)的預測由ProtParam (http://www.expasy. org/tools/protparam. html)完成。蛋白質二級結構預測由PSIPRED v3.3 Predict Secondary Structure (http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/)完成。蛋白質序列區域(domains)分析由InterProScan 4 (http://www. ebi. ac. uk/Tools/pfa/iprscan/)完成。蛋白質三級結構預測由Swiss Model Server (http://swissmodel.expasy.org/)完成。系統進化樹由Clustalx1.83 和MEGA5. 0 程序構建，采用鄰接法(Neighbor Joining Method)作圖，重復計算次數設為1000。氨基酸序列比對和一致性分析使用DNAMAN 5.2 軟件。系統進化樹和蛋白質二級結構預測結果編輯由ESPript 3(http://espript. ibcp. fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)完成。

1.4 基因的表達分析

基因組織表達分析使用大棚內生長材料。在生長期分別取其莖、葉，經液氮速凍后，在－70 ℃保存，用于不同組織中基因的表達分析。在采收期分別取馬鈴薯的起始匍匐莖、延伸匍匐莖、膨大匍匐莖、初始塊莖，液氮速凍后，置于－70 ℃保存，用于塊莖形成過程中的基因表達分析。

外源ABA 處理、鹽脅迫處理、PEG 模擬干旱處理的材料均來自于用MS 液體培養基培養45 d 左右的組培苗。外源ABA 處理:用20 mmol/L的ABA 噴施后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 取葉樣。鹽脅迫:用含有200 mmol/L NaCl 的MS 培養0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 后取葉樣。PEG 模擬干旱處理:用含有30% PEG-6000 的MS 培養0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 后取葉樣。

采用半定量RT-PCR 進行基因表達分析，內參基因為EF-1α，引物分別為EF-1α-F:5'-ATTCAAGTATGCCTGGGTGCT-3' 和 EF-1α-R:5'-GTGGTGGAGTCAATAATGAGGAC-3'，PCR 條件為:94 ℃預變性5 min;94 ℃40 s，55 ℃20 s，72 ℃20 s，24 個循環;72 ℃10 min。利用引物StPYL1 R/F、StPYL8 R/F 進行半定量RT-PCR 分別檢測基因StPYL1 和StPYL8 在馬鈴薯不同組織中的表達。PCR 擴增條件為94 ℃預變性5 min;94 ℃40 s，50 ℃30 s，72℃50 s，28 個循環;72 ℃10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 StPYL1 和StPYL8 的克隆及序列分析

以馬鈴薯cDNA 第一鏈為模板，用引物StPYL1 R/F;StPYL8 R/F 分別進行RT-PCR 擴增，得到兩個大小約750 bp 片段(圖1)。測序顯示，StPYL1 和StPYL8 長度分別為718 bp 和738 bp，基因StPYL1的ORF 長度為696 bp，編碼一個由231 個氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白的分子量為25 280，理論等電點為5.12;StPYL8 基因的ORF 長度為561 bp，編碼一個由186 個氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白的分子量為20 790，理論等電點為6.30。利用在線工具PSIPRED v3.3 分析蛋白質二級結構，發現StPYL1蛋白含有3 個α 螺旋、3 個β 折疊，StPYL8 蛋白含有2 個α 螺旋、4 個β 折疊(圖2)。InterProScan 4 分析發現，StPYL1 和StPYL8 蛋白都含有START-like 結構域(圖3)，利用基于同源建模的分析工具SWISSMODEL 進行3D 結構預測，在提交序列進行模板識別后，從蛋白數據庫(PDB)中選擇3nef.1. A 為模板，運用自動同源建模方式，通過X-射線晶體衍射比較發現，StPYL1 與擬南芥PYL1 基因編碼ABA 受體蛋白3nef(AtPYL1)相似性為73.98%［18］。同樣的方法，以3oqu.1.A 為模板建模，通過X-射線晶體衍射比較發現，StPYL8 與擬南芥PYL9 基因編碼ABA 受體蛋白3oqu(AtPYLP)相似性為78.79%［22］(圖4)。

圖1 馬鈴薯StPYL1(A)和StPYL8(B)基因cDNA 擴增條帶Fig.1 Agarose gel electrophoresis of amplification product of StPYL1(A)and StPYL8(B)cDNA from potato

圖3 馬鈴薯StPYL1 和StPYL8 結構域分析Fig.3 Analysis of StPYL1 and StPYL8 domains

圖4 StPYL1(A)、StPYL8(C)與AtPYL1(B)、AtPYL9(D)三級結構模型Fig.4 Tertiary structure models of StPYL1(A)，StPYL8(C)，AtPYL1(B)and AtPYL9(D)

StPYL1 與StPYL8 蛋白一致性是37. 02%，StPYL1 與其他23 種PYL 的氨基酸序列相似性為33% ～62%，其中與擬南芥AtPYL1 同源性最高。StPYL8 與其他23 種PYL 的氨基酸序列相似性為37% ～72%，其中與苜蓿MtPYL9 同源性最高(圖2)。進化分析結果顯示，24 種PYL 蛋白具有相同的進化起源，StPYL1 與苜蓿MtPYR1 進化親緣關系最近，StPYL8 與擬南芥AtPYL8 的進化親緣關系最近。在擬南芥中，PYL 家族被分成3 個亞家族，根據這種分類標準，StPYL1 和StPYL8 分別屬于亞家族Ⅲ、亞家族Ⅰ［14-15］(圖5)。

2.2 基因StPYL1 和StPYL8 組織表達分析

利用半定量RT-PCR 方法檢測了馬鈴薯植株不同部位的StPYL1 和StPYL8 mRNA 水平。在莖、葉中，均能檢測到StPYL1 和StPYL8 表達，但是，StPYL1 在莖中表達較為強烈，且略強于StPYL8，在葉中有微弱表達;而StPYL8 在葉中的表達水平高于其在莖的表達水平，且強于StPYL1 在葉中表達水平。在塊莖分化與發育過程中，StPYL1 和StPYL8均有不同程度的表達，然而，整個發育過程中StPYL8 表達強于StPYL1;StPYL1 在起始匍匐莖中表達略強于延伸匍匐莖、膨大匍匐莖和初始塊莖;StPYL8 在起始匍匐莖、膨大匍匐莖和初始塊莖中表達量大于延伸匍匐莖(圖6)。

2.3 基因StPYL1 和StPYL8 對外源ABA、鹽脅迫與干旱脅迫的表達響應

外源ABA 處理以后，StPYL1 與StPYL8 表達量均上調，一段時間后達到峰值，隨后逐漸下降。30%PEG-6000 處理后，隨著時間變化，StPYL1 表達量變化不明顯，StPYL8 表達量逐漸增加，24 h 達到峰值，隨后表達量逐漸下降。200 mmol/L NaCl 處理后，StPYL1 表達量沒有發生明顯變化，StPYL8 基因上調表達，48 h 表達量達到峰值，隨后下降(圖7)。

3 討論

圖5 StPYL1 和StPYL8 的系統發育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of StPYL1 and stPYL8

圖6 StPYL1 和StPYL8 的組織表達分析Fig.6 Expression analysis of StPYL1 and StPYL8 in different tissues

植物內源激素ABA 具有廣泛的生物學功能，參與植物生長發育各個階段以及植物應對環境脅迫的分子調控過程。大量的研究結果表明，PYL、PP2C和SnRK2 這3 種信號組份在ABA 信號轉導途徑中相互聯系，共同組成一個雙重負調控系統，通過調節下游的作用元件而形成一條完整的ABA 信號通路［13-14，23］。根據PYL 蛋白家族在擬南芥中的分類，本試驗克隆得到的StPYL1 和StPYL8 兩個基因分別屬于Ⅲ類和Ⅰ類。進化分析發現StPYL1 與Mt-PYR1、StPYL8 與AtPYL8 有較近的親緣關系。結構域預測發現StPYL1 與StPYL8 都含有START-like結構域，這與已知的PYL 蛋白結構特點相一致［13-15，18，22］。3D 結構預測分析表明，StPYL1 與At-PYL1、StPYL8 與AtPYL9 結構相似性較高。上述分析結果都證明StPYL1 和StPYL8 可能是ABA 受體蛋白。

圖7 ABA、干旱和NaCl 處理對StPYL1 和StPYL8 基因表達影響Fig.7 StPYL1 and StPYL8 genes expressions in potato exposed to ABA，drought and NaCl treatments

在組織表達特性上，StPYL1 和StPYL8 在同一組織中表達量有所差異，在葉片中，StPYL1 有微弱表達，而StPYL8 表達較為強烈;在莖中，StPYL1 表達強于StPYL8。這點與擬南芥AtPYR1 和AtPYL8基因在莖和葉中的表達特征相似［24］。在擬南芥中還發現，PYR1，PYL1，PYL2，PYL4，PYL5 和PYL8 等基因在葉片和莖中表達集中在維管束組織，值得一提的是，維管束是許多植物逆境應答的傳導通道，并且免疫學研究結果證實維管束薄壁組織細胞中含有大量的NCED3，ABA2 和AAO3 等ABA 合成相關酶［24-25］。在馬鈴薯塊莖形成過程中，StPYL1 表達水平變化不明顯，且表達量較低;相對而言，StPYL8 表達量較高，并且不同塊莖發育時期，表達量有所變化。表明基因StPYL8 可能參與了馬鈴薯的塊莖發育過程但機理尚需要進一步研究。

馬鈴薯幼苗經過外源ABA 處理后，StPYL1 與StPYL8 表達量增加，表明二者均受外源ABA 誘導。研究發現，外源ABA 處理擬南芥幼苗，隨時間延長，PYR1、PYL1、PYL4、PYL5、PYL6、PYL8 表達量逐漸下調，PYL2、PYL3 表達量逐漸上調，PYL7、PYL9 表達量上調至峰值后逐漸下降［26］。StPYL1 與AtPYR1、AtPYL1;StPYL8 與AtPYL8 氨基酸序列一致性較高，但是它們在不同物種中受ABA 誘導表達特征的不同之處值得深入探討。干旱和鹽脅迫處理后，StPYL1 表達量沒有發生顯著性的變化，StPYL8 表達量上調，表明StPYL8 參與了上述逆境調控。與野生型相比較，擬南芥pyr1/pyl1/pyl2/pyl4/pyl5/pyl8 6突變體植株生長遲緩、植株矮小，氣孔開放度明顯增大，葉片氣體交換速度加快，干燥環境下失水較快［27］。基因AtPYL8 受鹽脅迫誘導表達，并且PYL8過表達植株對鹽脅迫和甘露醇滲透脅迫表現的更加敏感，相對于野生型植株，RAB18、P5CS1、RD29A 和RD29B 等已知的ABA 應答基因在過表達植株中表達量顯著增加［28］。上述結果都證明PYL 基因參與了植物應激反應，在逆境調控中發揮著重要作用［29］。在馬鈴薯中StPYL1 與StPYL8 雖同為ABA受體蛋白，但是參與環境脅迫響應的調節方式可能不同。

在對擬南芥的研究中發現，pyr1/pyl1/pyl2/pyl4/pyl5/pyl8 6 突變體對ABA 超不敏感，PYL9、PYL5 和PYL8 的過表達植株在種子萌發、營養生長、基因表達和氣孔運動等多種生理過程中都表現出對ABA 更加敏感，且植株的耐旱能力顯著增強［13，28-30］，這些都表明PYL 在ABA 信號轉導中的起著重要作用。

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