基于rDNA-ITS 序列的天門冬擬莖點霉與相似種的系統發育關系

盧松茂， 陳振東， 林秀香， 鄭少緣， 余智城

(福建省熱帶作物科學研究所，福建 漳州363001)

蘆筍(Asparagus officinalis L.)又名石刁柏，素有“蔬菜之王”的美稱，富含多種氨基酸、蛋白質、維生素及人體所需的微量元素等［1］。中國已成為世界上生產和出口蘆筍數量最大的國家［2］。蘆筍莖枯病(Asparagus stem blight)是蘆筍的一種毀滅性病害，其病原菌最初由Saccardo［3］命名為天門冬莖點霉(Phoma asparagi)，而后Bubak［4］將其更正為天門冬擬莖點霉(Phomopsis asparagi)，并一直沿用到現在。當前，P. asparagi 在國內外的蘆筍產區均有發生危害，國內主要分布在福建、山東、海南、山西、河南、臺灣等省［5-7］，國外主要分布在美國、歐洲、澳大利亞、意大利、新西蘭、希臘等國家［8-10］。在發病嚴重的地區發病率達100%［11-12］，病情指數達50 ～70［13］，導致蘆筍植株整株干枯，嚴重影響蘆筍的品質和產量。

核糖體DNA 內轉錄間隔區(rDNA-ITS)序列是介于18S rDNA、5.8S rDNA 和28S rDNA 之間的區域，該區域進化速度較編碼區快，在種內不同菌株間高度保守，而在真菌的種間存在著豐富的變化［14-15］。rDNA-ITS 序列測定和比對為大量生物的系統發育和親緣關系的鑒定提供了有價值的參考，己被廣泛應用于親緣關系較近分類群的系統發育研究［16］。Murali 等［17］利用rDNA-ITS 序列分析結果表明寄生在柚木上的內生菌Phomopsis 存在多個不同的組群。Kanematsu 等［18］從形態特征觀察和ITS 序列分析認為寄生在薔薇科果樹上的Phomopsis 與P.asparagi 在分子系統發育上存在差異。目前，尚未見基于rDNA-ITS 序列對P. asparagi 與寄生在其他蔬菜、果樹和經濟林木上的Phomopsis 菌株進行系統發育分析的研究報道。本研究對分離自福建漳州不同地區的3 個P. asparagi 菌株的ITS 序列進行測定，并對P. asparagi 菌株與GenBank 中登錄的寄生在其他蔬菜、果樹和經濟林木上的19 個種的擬莖點霉菌株的ITS 序列(共35 條)進行多序列比對分析，以進一步揭示P. asparagi 與擬莖點霉屬其他重要種的系統發育關系，為P. asparagi 的分子鑒定及其分子進化關系研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

于2010 ～2013 年，在福建省東山縣蘆筍產區和福建省熱帶作物科學研究所內蘆筍試驗地采集具有蘆筍莖枯病典型癥狀的莖稈組織，采用常規組織分離法［19］對病斑上的病菌進行分離和純化，并參照盧松茂等［20］方法進行形態特征鑒定和致病性測定，獲得3 個Phomopsis asparagi 菌株(PDL、PQW、PWF)，在恒溫培養箱中25 ℃、12 h 光暗交替條件下用燕麥培養基(OA)培養7 d，備用。

1.2 菌絲體的收集及基因組DNA 的提取

將已在燕麥培養基(OA)上25 ℃條件下生長7 d 的3 個Phomopsis asparagi 菌株(PDL、PQW、PWF)菌落邊緣分別切取直徑為5 mm 的菌餅，接種至裝有100 ml 馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PD)的三角瓶上，每瓶接3 塊菌餅，在25 ℃、120 r/min條件下振蕩培養7 d。用紗布過濾菌液，獲得菌絲置于無菌的濾紙上吸去水分，55 ℃下烘30 min。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)法提取基因組DNA［21］。

1.3 PCR 擴增及測序

利用真菌ITS 通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和下游引物ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴增病菌rDNA-ITS 序列。PCR 反應體系組成成分為:10 × Buffer(含MgCl2)2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)0.5 μl，ITS1 和ITS4(10 μmol/L)各1.5 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 17.8 μl。PCR 反應程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環;72 ℃延伸10 min。PCR 產物用質量分數1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶清晰的PCR 擴增產物送上海生工雙向測序。

1.4 供試菌株ITS 序列分析

將供試菌株PDL、PQW、PWF 的ITS 序列分別與GenBank 中核酸數據庫進行BLAST 分析，比較同源性。用Clustal X、SeqMan 等軟件分析供試菌株PDL、PQW、PWF 與已發表的P. asparagi 菌株(GenBank 登錄號:JQ070363)的核糖體DNA-ITS序列差異，分析其5.8S 及其側翼的ITS 區的變異情況。

1.5 基于ITS 序列構建系統發育樹

將供試菌株(PDL、PQW、PWF)及來自GenBank登錄的寄生在其他蔬菜、果樹、經濟林木等上的35個擬莖點霉菌株(表1)的ITS 序列用Clustal X 軟件進行多序列比對分析，并用MEGA5.0 軟件的Neighbor-Joining 法構建系統發育樹，Bootstrap 檢驗1 000次。

表1 35 個擬莖點霉菌株及來源Table 1 35 Phomopsis strains and their sources

2 結果與分析

2.1 供試菌株核糖體ITS 序列分析

分別以提取的PDL、PQW 和PWF 菌株基因組DNA 為模板，用真菌通用引物ITS1 和ITS4 進行PCR 擴增，產物經電泳后均得到大小約為600 bp 的DNA 片段(圖1)。上海生工雙向測序結果顯示，PDL、PQW 和PWF 菌株的片段大小與預測的較為一致，它們的ITS 序列長度分別為585 bp、585 bp、587 bp。將PDL、PQW 和PWF 菌株的ITS 序列提交至NCBI 后，獲取登錄號分別為KJ801804、KJ801805、KJ801806。三者的ITS1-5.8S-ITS2 序列的一致性達100%，其中rDNA-ITS1 全長為173 bp，5.8S 全長為159 bp，rDNA-ITS2 全長為160 bp。它們與P. asparagi 菌株Pa1100(GenBank 登錄號:JQ070363)ITS1-5.8S-ITS2 序列的同源性達99. 8%，僅在rDNA-ITS2 有1 個堿基的差異，由堿基A→G 單堿基轉換。由此說明P. asparagi 同種內的不同個體之間的ITS 序列是非常保守的。

2.2 基于ITS 序列的擬莖點霉菌株的系統發育分析

圖1 3 株P. asparagi 菌株的PCR 產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of three strains of P. asparagi

將35 個擬莖點霉菌株的ITS 序列進行多序列比對分析，采用Neighbor-Joining 法構建了系統發育樹，結果(圖2)顯示，35 個菌株被劃分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組群，且除Diaporthe sojae、Phomopsis longicolla、P. mali 和P. castaneae 外，同一組群的不同種分別聚在不同的分支上，表明寄生在蔬菜、水果和經濟林木等植物上的擬莖點霉之間的ITS 序列存在一定差異。其中，P. asparagi與寄生葡萄的P. viticola、馬尾松的P. phyllanthicola、楊桃的P. averrhoae、芒果的Diaporthe phaseolorum 等菌株聚在I 組群的A 亞群，它們之間的ITS 序列差異小，表明它們之間的親緣關系近，但又存在一定分化;Ⅰ組群B 亞群的擬莖點霉(P. ternstroemia、P. azadirachtae、P.mali、P. castaneae、P. perniciosa、P. fukushii)及C 亞群的擬莖點霉(P. longanae)與P. asparagi 的親緣關系次之;寄生在葫蘆、黃瓜、野生大豆、大豆、茄子和柑橘等植物上的擬莖點霉分別聚在Ⅱ組群的A 和B 亞群，該組群的菌株與P. asparagi 的ITS 序列差異較大，它們之間的親緣關系較遠;而單獨聚在Ⅲ組群的寄生草莓的P. obscurans 菌株與P. asparagi 的ITS 序列差異最大，表明它們之間的親緣關系最遠。

圖2 基于P. asparagi 及其近似種的rDAN-ITS 序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of P. asparagi and related speices based on their rDAN-ITS sequences

3 討論

擬莖點霉屬真菌已描述有400 多個種［22］，主要為植物致病菌、植物內生菌或腐生菌，甚至危害人和動物［23］，其分類主要依據形態特征、培養特征和寄主范圍［24］，但其分子進化關系尚不十分清楚。rDNA-ITS 序列已廣泛應用于真菌的分子鑒定、親緣關系分析及系統發育研究。陳永青等［25］采用rDNAITS 序列分析法對寄生在木棉、發財樹、榴蓮、番石榴、芒果、楊梅、柚等植物上的擬莖點霉屬7 個種15個菌株進行了系統發育分析，但未涉及P. asparagi。楊迎青等［7］對河北、江西、海南、山東和福建等5 省區的天門冬擬莖點霉的形態特征及ITS 序列進行分析，證實了P. asparagi 存在地域差異，但未研究P.asparagi 與近似種如P. viticola、P. longicolla、P. obscurans、P. vexans、P. fukushii 等的分子進化關系。本研究探明了P. asparagi 與寄生在蔬菜、水果和經濟林木等植物上的擬莖點霉屬重要種的系統發育關系，為P. asparagi 的分子鑒定及親緣關系分析提供一定的理論參考。

楊迎青等［7］研究認為P. asparagi(JQ619526)與P. phyllanthicola(JN107737)聚在一起，且支持率達92%，它們的親緣關系最近，而本研究結果顯示，P. asparagi (KJ801804、KJ801805、KJ8018046、JQ070363)與P. phyllanthicola(JN107737)不聚在同一分支上，這可能與不同的P.asparagi 菌株有關。

系統發育樹顯示，寄生紅豆杉的P. mali(KF574900)菌 株 與 寄 生 板 栗 的 P. castaneae(JF957786)菌株聚在同一分支上，且自展支持率為100%，表明它們的ITS 序列差異小，推測為異名同物，但有待對它們的形態特征進行分析驗證。同時，寄生大豆的P. longicolla(無性態)菌株和寄生野生大豆的Diaporthe sojae(有性態)菌株也聚在同一分支上，且自展支持率為100%，這與Gomes 等［23］報道它們屬于同1 個種是一致的。Zhang 等［26］認為盡管序列有相似之處，但P. longicolla 與Diaporthe sojae 為不同的種，這可能與不同的分離菌株(P.longicolla 和Diaporthe sojae)存在差異有關。

本研究中用于分析的擬莖點霉菌株的ITS 序列有3 個為自測序列，其余大部分為已發表文獻中的ITS 序列，這為數據分析的準確性及代表性提供重要基礎，但它們的形態特征及生物學特性等差異有待進一步的比較分析。

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