實時熒光定量PCR對乙肝DNA檢測的影響及管理

□沈 剛SHEN Gang

乙型病毒性肝炎是我國傳播范圍最廣、危害性最大的一種感染性疾病，以肝臟炎性病變為主要表現，容易在此基礎上繼發肝硬化、慢性肝炎和原發性肝細胞癌等嚴重疾病，危及患者生命安全[1]。乙肝病毒是乙型病毒性肝炎的感染病毒，當前對其檢測最為有效的方法即為實時熒光定量PCR（聚合酶鏈式反應）檢測技術，其將熒光標志技術與PCR技術相結合，在對乙肝病毒DNA的檢測中具有特異性強、靈敏度高等優點[2]，但是HBV-DNA的檢測目前還沒有一個統一的標準，對于相同標本，使用不同儀器、不同試劑檢測所得出的結果差別較大。本研究對采用實時熒光定量PCR方法檢測乙肝DNA的影響因素進行分析，同時提出有針對性的管理建議，現報告如下。

資料與方法

1.臨床資料。選取2011年8月至2014年10月我院收治并已確診的395例乙型肝炎病毒感染患者為研究對象，其中男性184例，女性211例；患者年齡16～65歲，平均(49.75±9.53)歲。

2.方法。對395例患者進行血標本制作，空腹狀態下抽取肘靜脈血，置入黃蓋血清管，離心后取血清進行實時熒光定量PCR檢測乙肝DNA。核酸擴增條件：95℃條件下預變性3min，94℃(30sec) 60℃（15sec）循環40次，反應結束后，制作標準曲線，計算得出標本中的DNA模板量，根據試劑盒的陽性質控標準進行標本的陽性質控。本研究中所用試劑為艾康生物科技有限公司生產的乙肝DNA檢測試劑盒，所用儀器為美國ABI公司生產的StepOne實時熒光定量分析儀。以臨床診斷結果為對照標準，對比實時熒光定量PCR檢測乙肝DNA結果差異，并對導致兩者間差異的影響因素進行分析。

3.統計學分析。采用SPSS20.0統計軟件進行分析，計數資料以頻率及百分率表示，組間比較采用配對卡方檢驗，檢驗水準а=0.05。當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

結果

1.檢測結果對比。通過實時熒光定量PCR技術檢測乙肝DNA確診374例，占94.7%，漏診誤診21例，占5.3%，兩者對比差異未見顯著性差異(P＞0.05)，說明該方法的診斷準確率較高。

2.影響因素分析。對影響檢測結果的因素進行分析，主要包括實驗室條件、標本操作（標本抗凝血操作、標本貯存與溶血和血脂影響）以及核酸提取方法等。見表1。

表1 影響因素分析

討論

1.實驗室條件影響因素。PCR技術的最大特點是具備極高的靈敏度，但同時極其微量的污染即可造成假陽性結果的產生[3]。因此，臨床基因擴增檢驗實驗室的技術驗收和規范化管理是在臨床上應用此項技術的基本前提。臨床基因擴增檢驗實驗室原則上應分為四個單獨的工作區域，包括試劑貯存區、標本制備區、擴增區及擴增產物分析區，另外對人員培訓和操作規程也有具體要求。本研究中，由于實驗室條件影響因素造成漏診誤診3例，占14.3%，說明實驗室的硬件建設與軟件規范均應有所加強。

2.標本因素影響。包括標本抗凝血因素、貯存因素及溶血和血脂因素等。

2.1 標本抗凝血因素。由于機體在感染乙肝病毒后會血液中會出現乙肝病毒DNA，因此HBV-DNA的檢測一般都以血清或血漿作為標本。正常情況下EDTA抗凝(紫管)血漿、枸櫞酸鈉(黑管)血漿都可以用于進行HBV-DNA PCR檢測。EDTA與枸櫞酸鈉雖然都能結合Mg2+，但由于水平充足，不會影響最終的檢測結果[4]。而肝素作為核酸檢測常用的血液抗凝劑，能抑制聚合酶的活性，被公認為PCR反應抑制劑，在使用肝素作為抗凝素時，會導致標本的裂解失效，實時熒光定量PCR無法對血漿和血清進行有效檢測，產生假陰性結果。因此在PCR檢測中，盡量避免使用肝素作為抗凝劑。

2.2 標本存儲的影響。由于標本量及檢測周期原因，大部分實驗室不會每天進行HBV-DNA檢測，因此標本的貯存相當重要。由于細胞內的酶對DNA具有降解，如靜止時間超過3小時，或貯存溫度超過25℃時，會造成標本變性，影響檢測結果[5]。所以臨床貯存標本HBV-DNA應在及時分離血清或血漿的前提下，將其于-20℃以下環境貯存。

2.3 溶血及血脂因素。溶血和血脂會造成血液內血紅蛋白變形，導致熒光信息強度發生變化，影響檢測結果。理論上講血紅素可以經卟琳環與Taq酶發生不可逆的結合，從而抑制后者活性，因此標本發生溶血時會對HBV-DNA的檢測結果帶來明顯影響。但也有實驗證明，對發生溶血的HBV-DNA標本與未溶血標本之間檢測結果進行對比，差異并無統計學意義(P＞0.05)，其原因或許在于血紅蛋白經100℃10分鐘后，已經發生變性，喪失了結合Taq酶的活性，或者在提取核酸前，經過高速離心沉淀HBV顆粒、棄去上清等處理，大大降低了血紅蛋白帶來的影響。血脂因素可導致熒光淬滅，降低熒光信號強度，同時脂肪或其代謝產物能抑制Taq酶的活性，降低擴增效率，導致檢測結果降低。但亦有實驗證明，高血脂對檢測結果并無顯著影響。尹琦和徐玉蟬等[6]研究發現，三酰甘油小于或等于45.96 mmol/L時，并不會對檢測結果產生影。

黃翔等[7]通過PEG沉淀煮沸法發現，在膽固醇未高于12mmol/L情況下同，HBV-DNA的檢測結果與膽固醇水平間并無顯著相關性，說明PEG沉淀煮沸法能有效地去除標本中的膽固醇，提高擴增效率。

3.核酸提取方法的影響。采用不同的核酸提取方法對于采用實時熒光定量PCR技術檢測血清HBV-DNA結果差異較大[8]。李金明等[9]研究發現，在應用PCR技術對HBV-DNA進行檢測時，使用煮沸裂解法處理血清標本的效果較差，而應采用核酸純化方法。陳曉東等[10]認為，磁珠核酸提取法應作為PCR技術中檢測中的首選方法，其檢測結果與沉淀煮沸裂解法和直接煮沸裂解法均存在顯著性差異(P＜0.05)，其中直接煮沸裂解法的提取效率最低，少于磁珠核酸提取法兩個數量級。

通過上述分析，我們認為在應用實時熒光定量PCR對HBV-DNA進行檢測時，需注意以下幾點：首先要嚴格規范實驗室硬件與軟件建設，規范實驗室檢查條件，嚴格遵循分區原則，實驗室人員要嚴格單向走動，避免跨區操作，同時在室內安裝通風設備，注意對空氣有可能會引起檢查誤差的物質進行及時排除。其次，嚴格進行試劑盒的選擇；采集標本時要防止污染，避免表皮、體液細胞及頭發等成分的混入；處理標本采用帶濾芯吸頭，并保證一人一個吸頭，防止發生氣溶膠污染；在標本貯存時采用專用冰箱，對于拆封及未拆封的試劑分開放置，認真登記有效期；最后，對實驗室人員進行培訓，以提高專業技能，掌握儀器必要的使用和維護技術，定期對儀器及用具進行嚴格消毒。

綜上所述，實時熒光定量PCR在HBV-DNA的檢測中準確率較高，具有較高應用價值，但仍有一定的漏診和誤診率，需加強管理，在多方面進行綜合預防。

1 郭楠，李寶萍，李慧萍，等. 反應體系對熒光定量PCR檢測乙肝核酸結果影響的分析[J].中國實驗診斷學，2013,17(5)：877-879

2 范公忍，韓聚強，胡學玲，等.兩種核酸提取方法對血清HBV DNA熒光定量檢測結果的影響[J].中國衛生檢驗雜志，2013,23(9)：2110-2112,2114

3 郝維敏，劉杰，楊曉春.標本因素對熒光定量PCR檢測HBV DNA的影響[J].蚌埠醫學院學報，2011,36(3)：295-297

4 高國生，姜俊，翁彭劍.不同標本因素對熒光定量PCR法測定HBV DNA結果的影響[J].現代實用醫學，2010,22(1)：37-38

5 胡玉弘，陳玲玲，馮軍.標本存放時間對熒光定量PCR檢測HBV-DNA結果的影響[J].中國醫學創新，2010,7(24)：7-8

6 尹琦，徐玉蟬.影響HBV DNA測定的標本因素[J].臨床檢驗雜志，2008,26(2)：133-134

7 黃翔，王暉，周志明，等.溶血和脂血標本中乙肝病毒DNA提取方法的選擇與評價[J].華中醫學雜志，2004,28(2)：123-124

8 梅玉峰，黃敏，危艷順.濃縮裂解煮沸法在熒光定量PCR測定HBV DNA中的應用[J].檢驗醫學與臨床，2009,6(5)：359-360

9 李金明，王露楠，鄧巍.標本處理對聚合酶鏈反應測定乙肝病毒核酸的影響[J].中華檢驗醫學雜志，2000,23(6)：337-339

10 陳曉東，陶志華，周武.核酸提取方法在聚合酶鏈反應測定乙肝病毒核酸中的評價[J].中華檢驗醫學雜志，2002,25(4)：212-214