克服單倍體相合造血干細胞移植免疫屏障的策略

何祎，韓明哲（中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院血液學研究所移植中心，天津 300020）

異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）是惡性血液病的有效治療手段，供者來源困難一直限制了此項技術(shù)的廣泛應用。單倍體相合造血干細胞移植（haplo-HSCT）使3/6相合親屬移植成為可能，其中3/6相合親屬可來源于父母、同胞、堂兄妹、表親之一，幾乎能為100%的人群找到供者，有望從根本上解決供者來源問題。haplo-HSCT還具有易于取得干細胞以及今后有可能再次采集供者干細胞進行細胞治療等優(yōu)點，從而引起人們的廣泛關(guān)注。同時由于供受者人類白細胞抗原（HLA）差異性增大，使得克服HLA免疫屏障的難度增加。本文就近年人們在克服haplo-HSCT免疫屏障方面采取的策略做一綜述。

1 體外T細胞去除（TCD）的單倍體造血干細胞移植

1.1 體外廣泛TCD：Perugia等［1］采用免疫磁珠分選CD34+細胞的方法進行移植物體外TCD。他們獲得的移植物含有大劑量CD34+細胞（平均≥10×106/kg受者體重），并且CD3+細胞數(shù)量減少3～4個對數(shù)級。這一移植模式可以確保高植入率，盡管移植后不進行移植物抗宿主病（GVHD）的預防，GVHD的發(fā)生率也很低，但由于有助于移植后免疫重建的自然殺傷（NK）細胞、單核細胞以及樹突狀細胞（DCs）等也同時被去除，這種模式在移植后免疫重建緩慢，機會性感染（如病毒和真菌感染）的發(fā)生率增加，非復發(fā)病死率較高。Perugia小組［2］在現(xiàn)有模式的基礎上進一步研究了移植后過繼回輸調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）對免疫重建的影響，并首次證實了通過過繼回輸Tregs能夠促進淋巴細胞重建，并改進對機會性病原菌的免疫重建，而不減弱移植物抗白血病（GVL）效應。這一發(fā)現(xiàn)提示，為改善臨床預后進行過繼性輸注基因修飾的T細胞和/或病原體特異性T細胞的必要性。

1.2 體外選擇性TCD

1.2.1 選擇性去除CD3+/CD19+細胞：上文提到廣泛TCD模式移植后免疫重建延遲，有研究者提出采用移植物陰性選擇去除CD3+/CD19+細胞，可以保留NK細胞、單核細胞以及DCs等。與未經(jīng)處理的采集物移植相比，引起GVHD和B細胞淋巴增殖性疾病的發(fā)生率較低。最近一項研究顯示，61例成人高危惡性血液病患者接受了減低劑量預處理和移植物去除CD3+/CD19+細胞的haplo-HSCT。55/61的患者獲得植入，中性粒細胞數(shù)量大于0.5×109/L和血小板數(shù)量大于20×109/L的中位時間分別為12天和11天。Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD的發(fā)生率分別為46%和18%。100天和2年的非復發(fā)病死率（NRM）分別為23%和42%。2年復發(fā)率為 31%，總生存率（OS）為 28%［3］。

1.2.2 選擇性去除T細胞抗原受體（TCR）α、β+/CD19+細胞：γδT細胞是一群不引起GVHD但可能具有抗白血病作用的細胞［4］。有研究顯示，41例進展期血液病患兒接受了haplo-HSCT，移植物通過使用CliniMACS （美天旎）的免疫磁珠分選系統(tǒng)去除了TCRα、β+/CD19+細胞。植入率為88%，Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD發(fā)生率分別為10%和15%。CD3+細胞＞ 100/μl、CD19+細胞＞ 200/μl以及CD56+細胞＞200/μl的中位時間分別為13、127和12.5天，顯示免疫重建迅速［5］。

1.3 體外阻斷共刺激途徑誘導T細胞無能：T細胞活化的雙信號模型顯示T細胞必須接觸抗原（第一信號）和共刺激信號（第二信號）才能有效活化，當僅有抗原刺激而缺乏共刺激信號時，將導致抗原特異性T細胞耐受［6］。研究最多的共刺激分子對是T細胞上CD28受體和抗原呈遞細胞（APCs）上的B7-1（CD80）或B7-2（CD86）配體。細胞毒性T細胞抗原4（CTLA-4Ig）是一種重組融合蛋白，通過高親和力結(jié)合B7分子，能夠誘導T細胞耐受或無能，并防止B7分子和CD28的結(jié)合，有效阻斷第二信號的傳導。Guinan等［7］治療了11例haplo-HSCT患者，在加入CTLA-4Ig的條件下，將供者骨髓（BM）與照射后的受者細胞共孵育，使得受者反應性輔助T細胞數(shù)量減少1～4個對數(shù)級，而不影響輔助T細胞對第三者異基因抗原刺激的反應性。臨床結(jié)果顯示，所有11例患者均獲得植入，僅3例患者發(fā)生GVHD。

然而，上述所有體外TCD方法均治療費用昂貴，細胞處理過程繁瑣，需要有較高專業(yè)知識的人員指導參與，并非絕大多數(shù)移植中心均可廣泛實施。

2 T細胞充足（TCP）的單倍體造血干細胞移植

2.1 移植后高劑量環(huán)磷酰胺（PT/Cy）：當在移植后狹窄的窗口期給予高劑量環(huán)磷酰胺（Cy），即移植后高劑量環(huán)磷酰胺（PT/Cy），能去除供者和宿主同種反應性T細胞，抑制GVHD以及移植物排斥。作為藥物誘導免疫耐受的一種，PT/Cy策略利用的特性是增殖期同種反應性T細胞比靜息期非同種反應性T細胞對DNA損傷劑的細胞毒性作用更為敏感。210例惡性血液病患者在約翰霍普金斯大學接受了減低強度預處理和半倍體骨髓移植（BMT）及高劑量PT/Cy，累積Ⅱ～Ⅳ度、Ⅲ～Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD的發(fā)生率分別為27%、 5%和13%，2年累積復發(fā)率和NRM分別為51%和15%，2年無事件生存（EFS）為34%；79例患者死于惡性病復發(fā)，相反，僅15例患者死于機會性感染，5 例死于 GVHD［8］。

Ciurea等［9］比較了 TCP聯(lián)合 PT/Cy和 TCD兩種移植模式進行haplo-HSCT的療效，共65例患者入組，兩組患者均接受相同的預處理即氟達拉濱〔40 mg /（m2·d）×4〕、馬法蘭（140 mg/m2）以及噻替派（10 mg/kg）。在TCP組和TCD組中植入率分別為94%和81%（P=0.1）。一年NRM在TCP組和TCD組分別為16%和42%（P=0.03）。在TCP組和TCD組，累積的Ⅱ～Ⅳ度aGVHD和cGVHD分別為27%對11%（P=0.5）和8%對18%（P=0.03）。在TCP組和TCD組，一年OS和無進展生存期 （PFS） 分別為66%對30% （P=0.02）和45%對21%（P=0.03）。TCP組改善的NRM和移植后良好的T細胞免疫重建相關(guān)。另一項研究顯示，采用TCP聯(lián)合PT/Cy模式的單倍體移植后免疫重建優(yōu)于成人相合無關(guān)供者（MUD）或臍帶血移植，甚至達到同胞全合供者（MSD）移植水平。針對人類巨細胞病毒（CMV）特異性T細胞的迅速恢復可以解釋低的感染相關(guān)死亡，提示PT/Cy 模式保留了和重建感染免疫相關(guān)的靜息期記憶T 細胞［10］。

Bashey等［11］比較了 PT/Cy模式 haplo-HSCT（減低強度27例、清髓18例）和同期進行的HLA相合親緣供者（MRDs，n=115）及MUDs（n=99）移植的療效。生存患者中位隨訪時間為36個月（范圍9～74.5月）。36個月的OS在3種類型移植患者中沒有顯著性差異（在MRD、MUD和haplo-SCT分別為71%、58%和58%，P值無顯著性差異）。36個月無病生存率（DFS）分別為47%、46%和55%，3組亦無顯著差異。36個月預計的累積復發(fā)率在MRD、MUD和haplo-HSCT組分別為35%、38%和36%，差異亦無顯著性。這些結(jié)果提示，haplo-SCT的療效可以與MRD或MUD SCT相比。對于缺乏HLA相合供者的患者，部分不合同胞供者（PMRDs） 是一個可供選擇的供者來源。

同時，我們也應注意到，PT/Cy模式盡管植入率高，GVHD以及NRM發(fā)生率低，但移植后復發(fā)率高仍是今后需要著重解決的難題。相信隨著預處理方案的改進、移植后微小殘留病的監(jiān)測以及過繼免疫治療的開展，該模式的臨床療效會進一步提高。

2.2 供受者同時誘導免疫耐受的單倍體造血干細胞移植：國內(nèi)黃等［12-15］采用供受者同時誘導免疫耐受的haplo-HSCT，即不進行體外移植物處理，通過粒細胞集落刺激因子（G-CSF）體內(nèi)誘導供者免疫耐受，強免疫抑制（主要是ATG）誘導受者免疫耐受等措施，可有效控制HLA不合所致的同種反應性。G-CSF體內(nèi)應用后可使骨髓及外周血移植物內(nèi)免疫細胞的構(gòu)成發(fā)生改變，移植物內(nèi)T細胞增殖能力下降，細胞因子分泌Th1極化為Th2，故有利于免疫耐受的形成。ATG的作用機制如下［16-18］：① ATG在血液和外周淋巴組織通過補體依賴溶解、T細胞激活和凋亡發(fā)揮體內(nèi)TCD作用；② ATG調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細胞表面分子，包括整合素 a4b7、VLA-4、CXCR4、CCR5和 CCR7，從而導致白細胞/內(nèi)皮細胞相互作用；③ ATG誘導B細胞系和骨髓瘤細胞系的凋亡；④ ATG抑制髓系來源不成熟DCs的成熟，髓系來源不成熟DCs具有和耐受性DCs一致的表型；⑤ ATG誘導Treg和NK T細胞。Feng等［19］發(fā)現(xiàn)僅兔的ATG能夠促進功能性Tregs體外擴增。逆轉(zhuǎn)CD4+CD25-T細胞為Tregs，可以通過增強活化的T細胞核因子表達或誘導耐受性 DCs［20］。黃等［21］共報道 756例患者，3年預計的OS和無白血病生存率（LFS）分別為67%和63%。采用該方式因移植物中存在大量的T細胞可以促進免疫重建并預防復發(fā)，但同時急慢性GVHD發(fā)生率亦高于TCD模式，提示進一步改進GVHD預防的必要性。

總之，盡管近幾年人們在克服haplo-HSCT免疫屏障方面取得了長足進步，嘗試了多種克服單倍體移植HLA屏障的模式，但往往各有優(yōu)缺點，到目前為止還沒有一個公認的標準模式。創(chuàng)新的模式應向降低GVHD和植入失敗（GR）發(fā)生率、迅速的免疫重建、增強抗白血病和抗病原體免疫反應以及改善移植預后等方向發(fā)展。