結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術研究進展

章玉坤，張齊龍

·前沿進展·

結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術研究進展

章玉坤，張齊龍

本文闡述了近5年來結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術方面取得的研究進展，從細菌學、免疫學、分子生物學、生物化學及細胞學等角度進行分析、總結(jié)，認為雖然目前報道的結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術眾多，但仍然缺乏一種簡單、快捷、經(jīng)濟、可靠的實驗室診斷技術，而現(xiàn)有的實驗室診斷技術各有優(yōu)缺點;結(jié)核性腦膜炎的基礎研究方面還有很大發(fā)展空間，抗結(jié)核治療后的臨床隨訪對結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術的改良、創(chuàng)新有促進和啟發(fā)作用。

結(jié)核，腦膜;診斷;臨床實驗室技術;綜述

章玉坤，張齊龍．結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術研究進展［J］．實用心腦肺血管病雜志，2015，23(1):9－12．［www．syxnf．net］

Zhang YK，Zhang QL．Progress on laboratory diagnosis technology of tubercular meningitis［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(1):9－12．

在全球范圍內(nèi)，結(jié)核性腦膜炎在肺結(jié)核中占有很大比例，其發(fā)病率和病死率均很高，尤其是在患兒和HIV感染患者中。由于結(jié)核性腦膜炎缺少特異性臨床表現(xiàn)，因此確診較難，目前的實驗室診斷技術對結(jié)核性腦膜炎的靈敏度和特異度也較低［1－2］。早期診斷和治療結(jié)核性腦膜炎可以挽救更多患者的生命，近年來關于結(jié)核性腦膜炎治療方面的研究已取得很大進展，并可能在不久的將來影響相關指南的制定，而其實驗室診斷技術方面研究相對不足。有鑒于此，筆者結(jié)合近5年來相關文獻，就結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術在細菌學、免疫學、分子生物學、生物化學、細胞學等［3］方面取得的進展進行綜述如下。

1 細菌學

腦脊液細菌學檢查是診斷結(jié)核性腦膜炎的“金標準”，其研究進展主要體現(xiàn)在以下3個方面:

1．1 腦脊液涂片由于結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)病原體，腦脊液中含量極少，因此采用常規(guī)的抗酸染色法檢出腦脊液中結(jié)核分枝桿菌常需要大量腦脊液標本，且檢測陽性率極低。我國第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院開發(fā)的一種改良抗酸染色法采用細胞離心涂片及Triton破膜技術進行標本處理，只需要0．5 ml腦脊液，該方法不僅提高了細胞外結(jié)核桿菌陽性檢出率，還能清晰顯示中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞等細胞內(nèi)結(jié)核桿菌，其較常規(guī)抗酸染色法更高效、更靈敏，是一項方便而準確的結(jié)核性腦膜炎快速診斷技術［4］。此外，免疫細胞化學染色腦脊液巨噬細胞胞質(zhì)分枝桿菌抗原診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度為73．5%，特異度為90．7%［5］。

1．2 腦脊液培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基進行腦脊液結(jié)核桿菌培養(yǎng)是傳統(tǒng)的結(jié)核性腦膜炎診斷方法，但該培養(yǎng)過程需要4～7周，常導致不恰當?shù)目菇Y(jié)核治療。在東京都立保健科學大學微生物學系進行的一項納入了100例疑似結(jié)核性腦膜炎患兒的觀察性研究中，研究者利用BACTEC分枝桿菌生長指示管(MGIT) 960系統(tǒng)作為一個快速驗證工具進行腦脊液分析，培養(yǎng)結(jié)果為陽性者行一線抗結(jié)核藥物敏感試驗，并與基于臨床特征的診斷結(jié)果進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100份腦脊液標本中只有14份標本培養(yǎng)結(jié)果為陽性，提示基于臨床特征的結(jié)核性腦膜炎診斷結(jié)果并不可靠;而BACTEC MGIT 960系統(tǒng)與腦脊液生化檢查對結(jié)核性腦膜炎的診斷價值間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P=2．260)，但與腦脊液細胞學檢查對結(jié)核性腦膜炎的診斷價值間存在統(tǒng)計學差異(P=0．001)，提示BACTEC MGIT 960系統(tǒng)可作為一種快速有效的肺外結(jié)核診斷技術［6］。

1．3 噬菌體生物擴增法(PhaB)PhaB的原理是分枝桿菌噬菌體能夠感染待檢標本中活分枝桿菌(結(jié)核分枝桿菌和少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌)并在菌體內(nèi)增殖，而未進入感染菌體內(nèi)的噬菌體則被隨后加入的滅活劑滅活，增殖的噬菌體將細菌裂解后釋放出的噬菌體可感染其他目標菌并將其裂解，導致瓊脂平板上出現(xiàn)噬菌斑，根據(jù)有無噬菌斑形成即可判定待檢標本中是否存在活分枝桿菌。PhaB檢測過程只需1～2 d，靈敏、簡便、價廉，還可同時進行臨床標本的直接藥敏試驗［7］，其已應用于結(jié)核分枝桿菌的快速檢測和耐藥性檢測［8］，但未見用于診斷結(jié)核性腦膜炎的報道，只是偶爾涉及體液標本中少量腦脊液標本檢查結(jié)果，因此其在結(jié)核性腦膜炎中的應用價值尚不清楚，有待進一步研究。

2 免疫學

2．1 細胞免疫結(jié)核分枝桿菌基因組分析方面取得的研究進展使得結(jié)核分枝桿菌特異性抗原得以發(fā)現(xiàn)，且這些抗原被發(fā)現(xiàn)后不久即用于診斷結(jié)核菌感染，其中ESAT－6和CFP－10具有很強的誘導致敏T細胞釋放干擾素γ(IFN－γ)作用，因此結(jié)核分枝桿菌特異性抗原試驗也被稱為γ－干擾素釋放試驗(IGRAs)。由于所有卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌均不含ESAT－6和CFP－10，因此，ESAT－6和CFP－10能準確鑒別卡介苗接種者和大部分非結(jié)核分枝桿菌感染者。目前市面上銷售的IGRAs試劑有兩種，即QuantiFERON－TB Gold(在日本稱為QFT－2G)和基于ELISPOT方法的T－SPOT．TB，大多數(shù)學者認為T－SPOT．TB較QFT－2G診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度更高，但這兩種試劑應用時間較短，仍存在一些問題亟待解決:(1)IGRAs不能區(qū)分活動性和潛伏性結(jié)核感染;(2) QFT－2G在血液標本以外標本中的應用及在T細胞反應中作用;(3)QFT－2G在判斷疾病預后方面的應用;(4)外周血及炎性病灶對結(jié)核桿菌抗原的特異性免疫反應，有學者采用漿膜腔積液標本進行IGRAs，可用于鑒別活動性結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎、結(jié)核性腦膜炎及結(jié)核性心包炎;(5)IGRAs在免疫系統(tǒng)脆弱患者(如嬰兒及艾滋病患者)中的應用、化療藥物的影響、對活動性結(jié)核患者預后的判斷、試驗質(zhì)量保證等，解決這些問題和改良IGRAs很重要，尚需基于基礎免疫學的研究［9］。

潛伏性結(jié)核感染的診斷和治療是全球結(jié)核病控制面臨的挑戰(zhàn)之一，結(jié)核菌素試驗是目前廣泛采用的潛伏性結(jié)核感染診斷方法，但特異度較低，因此，尋找特異性抗原取代結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物一直是國際研究重點。目前已確定的3種有診斷潛力的特異性抗原為ESAT－6、CFP－10和TB 7．7，在歐盟、美國和日本，這些抗原相關診斷試劑已經(jīng)進入市場銷售，其有助于識別潛伏結(jié)核感染者和結(jié)核病全球防控。近年研究發(fā)現(xiàn)，T－SPOT．TB較基于臨床特征的診斷標準對結(jié)核性腦膜炎的診斷價值更高，腦脊液單核細胞RD－1 ELISPOT檢測與其他快速驗證試驗相結(jié)合(革蘭染色和隱球菌乳膠凝集試驗)可用于結(jié)核病和艾滋病流行地區(qū)結(jié)核性腦膜炎的快速、準確診斷［10］，但在醫(yī)療資源匱乏地區(qū)，基于臨床特征的診斷標準可能對臨床醫(yī)生更為有用，因此，T－SPOT．TB可能只需要用在基于臨床特征的診斷可能性低于預先設定標準時，其診斷準確性仍需進一步研究證實［11］。

2．2 體液免疫在結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液標本中，除50 kDa免疫球蛋白重鏈、25 kDa免疫球蛋白輕鏈條帶外，還可看到清晰的12 kDa、30～32 kDa、71 kDa、86 kDa、96 kDa、110 kDa、120 kDa條帶及模糊的69 kDa人血清蛋白條帶，正常對照者腦脊液標本也顯示免疫球蛋白和人血清蛋白條帶，但無交叉反應抗原條帶，其中12 kDa(7．7%)、30～32 kDa (23．0%)、71 kDa(19．2%)、96 kDa(77．0%)、86 kDa (57．5%)、110 kDa(23．0%)及120 kDa(15．4%)條帶為反應帶，其結(jié)果要與反向被動乳膠凝集試驗做對比。腦脊液中至少出現(xiàn)1個分枝桿菌特異性抗原條帶診斷結(jié)核性腦膜炎的陽性率為88．4%，排除86 kDa特異性抗原后，免疫電泳斑點法(EITB)診斷結(jié)核性腦膜炎的特異度可達100%，但該診斷技術比較費時費力［12］。有研究顯示，阿拉伯甘露聚糖脂(LAM)抗原檢測診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度為64%、特異度為69% (LAM法切割點0．22)，而細菌學涂片診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度和特異度分別為0和100%，PCR診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度和特異度分別為93%和77%，LAM抗原檢測可作為高艾滋病毒感染率地區(qū)快速診斷結(jié)核性腦膜炎的有效輔助手段［13］。

目前，對應于結(jié)核分枝桿菌Ag 85復合物特異性抗原表位的4種肽(Ag 85肽1、2、3、4，均為7～10個氨基酸長)已被合成出來，且均能用于結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎患者血清和腦脊液標本ELISA。有學者對這4種肽的血清和腦脊液標本的診斷價值進行研究發(fā)現(xiàn)，Ag 85肽1、3、4在肺結(jié)核患者中陽性率最高，而Ag 85肽1、2在結(jié)核性腦膜炎患者中陽性率很高，Ag 85肽ELISA是一項診斷肺結(jié)核及肺外結(jié)核的早期、敏感、特異、快速、廉價、有效的免疫學技術，且該類合成肽較全抗原更易重復產(chǎn)生［14］。有學者報道，體液免疫反應(包括IgG和IgA抗體)中16 kDa抗原介導的間接ELISA診斷各類型肺結(jié)核的靈敏度為73．8%～81．2%，診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度為42．8%，診斷結(jié)核性胸腔積液的靈敏度為63．3%，且均具有很高的特異度(94．7%左右);而在所有的非疾病對照者中，16 kDa抗原介導的間接ELISA結(jié)果均為陰性［15］。

3 分子生物學

3．1 PCR腦脊液涂片及培養(yǎng)是診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核的“金標準”，其診斷過程復雜、耗時，診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度較低。近年來，以分子生物學研究為基礎的結(jié)核性腦膜炎診斷技術取得較大發(fā)展，其中核酸擴增(NAA)檢測技術(特別是PCR)由于快速、靈敏、特異而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核的診斷方面具有較廣闊的應用前景［16］。PCR較常規(guī)苯酚/三氯甲烷提取法靈敏度更高(84．2%比73．6%)，檢測過程更快速，技術要求更低，其中單管法程序簡單，可以早期、可靠地診斷結(jié)核性腦膜炎，是一項很有發(fā)展空間的實驗室診斷技術［17］，而檢測腦脊液中結(jié)核分枝桿菌glcB/HspX抗原/DevR DNA有可能提高目前的結(jié)核性腦膜炎診斷效能，并加快診斷速度［18］。

3．2 定量巢式實時PCR有學者對4種腦脊液標本結(jié)核分枝桿菌DNA檢測方法〔實時PCR、QIAGEN(R)、AMPLICOR (R)、MagNA Pure(R)〕進行比較發(fā)現(xiàn)，實時PCR的靈敏度高于其他方法，但無法檢測出＜100個結(jié)核分枝桿菌/ml者［19］。有學者采用蛋白B、MPB 64及IS6110引物多重PCR對18例確診結(jié)核性腦膜炎患者(腦脊液培養(yǎng)陽性)、92例疑診結(jié)核性腦膜炎患者、100例非結(jié)核性腦膜炎患者進行檢測發(fā)現(xiàn)，多重PCR對確診病例的靈敏度為94．4%，特異度為100．0%，對疑診病例的陽性檢出率為84．78%，鏡檢、腦脊液培養(yǎng)、多重PCR診斷結(jié)核性腦膜炎的總體靈敏度分別為1．8%、16．7%、86．6%，特異度均100．0%［20］;蛋白B PCR對確診病例的靈敏度為90．0%，特異度為100．0%，對疑診病例的陽性檢出率為81．7%，鏡檢、腦脊液培養(yǎng)、蛋白B PCR診斷結(jié)核性腦膜炎的總體靈敏度分別為1．4%，14．3%、82．8%，特異度均為100．0%［21］。巢式PCR診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度依次較Bac T/Alert、LJ培養(yǎng)、鏡檢為高，但由于巢式PCR假陽性率和假陰性率較高，因此其不能單獨作為啟動或終止抗結(jié)核治療的標準，而應該結(jié)合臨床、影像學、細胞學和微生物學檢查結(jié)果綜合判斷［22］。

3．3 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)有學者采用了6種識別結(jié)核分枝桿菌IS6110基因組序列的特異性引物(1個正向外引物、1個反向外引物、2個內(nèi)引物、2個環(huán)引物)來快速檢測和診斷結(jié)核性腦膜炎，其設定的最佳反應溫度和反應時間分別為63℃和60 min，結(jié)果顯示LAMP診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度和特異度分別為88．2%和80．0%，而巢式PCR分別為52．9%和90．0%［23］。

3．4 其他目前，線性探針雜交(LiPA)、基因芯片、Xpert Mtb/RIF檢測技術、高分辨熔鏈曲線分析等最新結(jié)核分枝桿菌檢測技術已應用于實驗室，但仍處于研發(fā)階段，尚無應用于臨床診斷結(jié)核性腦膜炎的研究報道［24］。

4 生物化學

4．1 腺苷脫氨酶(ADA)目前，已有較多文獻報道腦脊液ADA用于診斷結(jié)核性腦膜炎，但腦脊液ADA診斷結(jié)核性腦膜炎的界值還沒有達成共識，大多數(shù)學者認為9．5 U/L是腦脊液ADA鑒別診斷結(jié)核性腦膜炎的最佳臨界值，同時監(jiān)測結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液ADA變化可為評價抗結(jié)核治療效果提供參考［25］;但考慮到腦脊液ADA不能準確鑒別結(jié)核性腦膜炎和細菌性腦膜炎［26］，而疑診患者可能會接受不必要的抗結(jié)核治療，為提高診斷靈敏度和特異度，有學者建議將腦脊液ADA的最佳臨界值定為10．5 U/L［27］。有學者通過研究發(fā)現(xiàn)，把鑒別診斷結(jié)核性腦膜炎和非結(jié)核性腦膜炎的血清ADA水平定為15 U/L時，其靈敏度為84%、特異度為82%，聯(lián)合腦脊液ADA≥10 U/L和血清ADA≥15 U/L時，其特異度可達92%～97%。因此，腦脊液和血清ADA檢測是鑒別診斷結(jié)核性腦膜炎的一項簡單、可靠的實驗室診斷技術［28－29］。

4．2 神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)NSE是一種神經(jīng)組織損傷特異性生化標志物，有學者認為其較腦脊液/血清NSE對早期結(jié)核性腦膜炎的診斷效能更高［30］。

4．3 其他也有文獻報道將定量蛋白質(zhì)組學［31］、可溶性DLL－1等用于診斷結(jié)核性腦膜炎，但其實用價值尚有待進一步研究。

5 細胞學

結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液細胞數(shù)為100～1 000個/μl，并以淋巴細胞為主;有文獻報道結(jié)核感染者外周血或腦脊液T細胞、T細胞、γδ T細胞均明顯增加，并與疾病嚴重程度及患者預后密切相關。但細胞學檢查易受到多種因素影響，診斷結(jié)核性腦膜炎的特異度欠佳［32］。

6 小結(jié)

綜上所述，雖然目前報道的結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術眾多，但仍然缺乏一種簡單、快捷、經(jīng)濟、可靠的實驗室診斷技術，而現(xiàn)有的實驗室診斷技術各有優(yōu)缺點:(1)腦脊液細菌學檢查出結(jié)核分枝桿菌仍是診斷結(jié)核性腦膜炎的“金標準”，但腦脊液涂片陽性檢出率低，培養(yǎng)周期長，改良抗酸染色法及BACTEC MGIT 960系統(tǒng)對傳統(tǒng)腦脊液涂片方法有所改進;(2)以T－SPOT．TB為代表的免疫學檢查技術診斷結(jié)核性腦膜炎的靈敏度和特異度均很高，但其不能有效鑒別潛伏期感染及是否受到結(jié)核藥物等因素的影響，尚需進一步研究; (3)目前PCR技術已非常成熟，且應用廣泛，其診斷結(jié)核性腦膜炎的特異度接近100%，但由于靈敏度較高，核酸擴增過程中產(chǎn)生的假陽性問題亟待解決;(4)腦脊液/血清ADA、NSE等生化指標檢測對診斷結(jié)核性腦膜炎有一定幫助，但特異度較低;(5)實驗室技術人員技術水平參差不齊，其檢測效能和質(zhì)量控制高低不一。

筆者總結(jié)認為:(1)各級醫(yī)院應根據(jù)當?shù)貙嶋H情況選擇性開展結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術，并結(jié)合臨床以提高結(jié)核性腦膜炎診斷效率;(2)實驗室技術人員需進行規(guī)范培訓及系統(tǒng)學習，并對目前的實驗室診斷技術進行系統(tǒng)評價和比較，以了解各項診斷技術的優(yōu)缺點;(3)開展多部門、多學科協(xié)作，進行結(jié)核性腦膜炎診斷技術的創(chuàng)新性開發(fā);(4)結(jié)核性腦膜炎的基礎研究方面還有很大發(fā)展空間，抗結(jié)核治療后的臨床隨訪對結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷技術的改良、創(chuàng)新有促進和啟發(fā)作用。

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R 529．3

A

10．3969/j．issn．1008－5971．2015．01．004

2014－07－20;

2014－12－15)

(本文編輯:鹿飛飛)

·論著·

江西省自然科學基金(20114BAB205060)

330006江西省南昌市，江西省胸科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【編者按】女性、老年人均屬特殊人群，老年女性急性ST段抬高型心肌梗死患者更是特殊人群中的“特殊人群”，王麗等在既往研究基礎上通過探討這一特殊人群臨床特征及院內(nèi)死亡危險因素發(fā)現(xiàn)，老年女性急性ST段抬高型心肌梗死患者年齡偏大、非典型癥狀發(fā)生率較高、病情較重、誤診誤治率及院內(nèi)病死率較高，女性、腦鈉肽水平升高是老年急性ST段抬高型心肌梗死患者院內(nèi)死亡的獨立危險因素，提示臨床應更多地關注這一特殊人群。目前老年急性ST段抬高型心肌梗死患者出現(xiàn)明顯性別差異的具體機制尚不明確，期望能有更多相關研究進一步深入探討。