bFGF 對PTSD 樣大鼠海馬組織ERK 表達的影響

唐佳文，李想，邢雪松

(1.沈陽醫學院基礎醫學院臨床醫學專業2010 級11 班，遼寧 沈陽 110034;2.基礎醫學院臨床醫學專業2011 級8 班;3.基礎醫學院解剖學教研室)

近年來，我國遭遇的災難給人們帶來巨大財產損失的同時，也帶來嚴重的后遺癥——創傷后應激障礙(post trauma stress disorder，PTSD)。國內外學者研究發現，PTSD 患者有海馬萎縮、海馬功能活動下降以及N-乙酰天冬氨酸的減少。且中樞神經系統存在內源性神經干細胞(neural stem cell，NSCs)，尤其是室管膜下區和海馬齒狀回終生都存在不斷增殖分裂的NSCs。通過對內源性NSCs 增殖與分化的精細調控，使減少神經元凋亡，促進NSCs 的增殖、分化來修復腦神經組織成為可能。NSCs 增殖分化受多種基因調控，其中堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)上調誘導胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路，促進NSCs 增殖、分化成為當前研究熱點之一。本文針對bFGF 誘導ERK 在PTSD 樣大鼠海馬組織內源性NSCs 增殖分化影響做一綜述。

1 bFGF 概述

bFGF 是神經元、膠質細胞和毛細血管內皮細胞的促有絲分裂原，是一種含155個氨基酸的多肽，對于中胚層和神經外胚層源細胞具有顯著的促增殖作用，同時在神經系統的生長、發育、成熟過程中具有重要作用［1－2］。它與受體結合后，通過激活腺苷酸環化酶與鳥苷酸環化酶，進而導致蛋白激酶C 活化和Ca2+內流;或定位于細胞核，調節RNA 聚合酶I，加強核蛋白體基因的轉錄，以加速細胞周期間內的轉換、刺激細胞DNA 合成、促進細胞的增殖分裂。并且調節細胞的分化，維持神經組織生長和神經再生中軸突的延伸和存活，對維護中樞神經系統的正常生理功能起著重要作用［3－6］。

近年有研究指出在腦外傷后腦室內注射bFGF能有效促進內源性NSCs 的增殖，并讓這些新生的NSCs 存活至損傷后4 周［7］。且許多研究發現bFGF對胞外信號調節激酶具有顯著誘導上調NSCs 增殖分化、減少神經元凋亡的作用［8］。bFGF 通過細胞表面的酪氨酸激酶受體，激活Ras 蛋白磷酸化，Ras-GTP 直接與Raf 相結合，形成一個短暫的膜錨定信號后，活化的Raf 磷酸化促分裂原激活的蛋白激酶的激酶(mitogenactivatedp rotein kinase kinase，MEK)環上的絲氨酸殘基，進而將其激活。接著MEK 再將ERK 激活，磷酸化下游與胞質和胞膜相連著的底物［9］。從而ERK 被快速地轉運入細胞核，調節轉錄因子活性，誘導反應基因的表達，使細胞外信號最終進入細胞核，影響細胞的狀態和功能，參與調節細胞周期及促進細胞增殖分化［10］。

2 PTSD

2.1 PTSD 樣大鼠模型的建立 PTSD 是一種創傷后心理失衡狀態，臨床表現包括反復重現創傷性體驗、情感麻木、回避、警覺過強所致持續性焦慮、驚恐逃避以及易激惹癥狀等癥候群［11］。具有發病率高、患病率高、病程長、療效差等特點，對臨床治療來說是一大難關。尤其是參與戰爭的士兵，有數據提示戰爭導致的PTSD 的發生率高，并且隨著戰爭武器的進步有不斷提高的趨勢，如參加朝鮮戰爭的老兵PTSD 的發生率為32.1%，參加伊拉克、阿富汗戰爭老兵的發生率高達45%［12］。國內外學者研究指出，初期由于缺乏理想的模型，PTSD 的基礎研究受到很大的限制，探究PTSD 的發生發展及其發病機制，從而為PTSD的治療方法及藥物選擇方面也仍不理想，需要進一步深入研究［13］。近年來隨著捕食應激、社會應激、電擊、束縛+電擊、單次延長應激等經典模型的建立，PTSD 模型有了長足的發展，通過邊緣系統電刺激等方法，建立了良好的PTSD 的模型，加之逐步對構造模型方法的改良，現已有較成功理想的PTSD 模型。經循證數據研究顯示，SPS 模型在PTSD 樣模型中相對理想，基于此模型，PTSD發生發展中的相關機制及其他相關蛋白分子的研究已經成為當下的研究熱點［14］。

2.2 PTSD 發病機制 PTSD 是一種嚴重且預后較差的應激障礙，其病因及機制較為復雜，涉及遺傳、神經生物改變以及環境因素等，迄今尚未研究清楚。其中最主要的表現為中樞神經系統的病變，從而導致一系列的病理表現。研究發現，在PTSD 的發生發展中，中樞神經系統(central nervous system，CNS)主要有以下神經生物學機制的改變:(1)CNS 神經可塑性改變，海馬內Ca2+超載，引起Ca2+-CaM 信號通路的調控異常，從而CNS 神經可塑性改變，最終導致學習、記憶及行為等認知功能障礙與情緒反應異常。(2)CNS 內神經遞質的變化，如谷氨酸、去甲腎上腺素、兒茶酚胺等。(3)CNS 神經解剖學改變，如海馬體積的縮小，丘腦、扣帶回前部和中央前回的活動明顯減弱等。(4)HPA (hypothalamic-pituitary-adrenal)軸功能的改變，且HPA 軸是調節哺乳動物應激行為所致內分泌和行為反應最重要的神經調質之一。PTSD 所表現的各種精神癥狀，是與CNS對應激信息的記憶密切相關的，其中的信號機制尚未清楚，仍需進一步深入探究［15］。近期研究提示從蛋白水平和mRNA 轉錄水平可檢測到了PTSD大鼠前額皮質pERKI/2 的變化及其與反應基因cfos 的關系，指出ERK 信號轉導通路對PTSD 起著重要作用，因此為PTSD 機制的研究提供神經生化水平上的理論依據［16］。

3 ERK 表達對海馬組織中內源性NSCs 增殖研究的理論

3.1 ERK 信號轉導機制 在信號傳導酶類中，胞外信號調節激酶ERK 與細胞增殖分化或凋亡調控密切相關。ERK 是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族中的重要成員之一。目前根據序列的同源性和功能的不同，哺乳類生物細胞中已被研究發現5 條MAPK通路。ERK 就是APK 蛋白激酶體系中的一個亞族，是細胞內信號傳導通路的重要媒介，起著調節細胞生長和分化的作用。ERK 通路主要通過以下4 條途徑激活:(1)受體酪氨酸激酶Ras 的激活［17］;(2)Ca2+對Ras 的激活［18］;(3)蛋白激酶C 對ERK 通路的活化［19］;(4)G 蛋白偶聯受體對ERK 通路的激活［20］。各種細胞外信號如bFGF等通過細胞表面的酪氨酸激酶受體，使GTP 結合蛋白Ras 與Raf-1 結合并使后者激活，活化的MAPK將其下游底物MEK 的2個絲氨酸殘基磷酸化，而MEK 磷酸化后再將下游的ERK1 和ERK2 的酪氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，使ERK1 和ERK2 活化，活化的ERK 從細胞質進入細胞核，又促使下游底物Elk-1 以及cAMP 反應素結合蛋白(CREB)的磷酸化活化，調節轉錄因子活性，誘導c-fos、erg-1 和zif268等超早反應基因和晚反應基因的表達，使細胞外信號最終進入細胞核，影響細胞的狀態和功能，參與調節細胞周期及促進細胞增殖分化。

3.2 NSCs 增殖對受損海馬的作用 有研究顯示，哺乳類動物的中樞神經系統具有潛在的自我修復能力。成體腦內海馬(包括人類)齒狀回的亞顆粒層(subgranular zone，SGZ)和位于前腦側腦室的室周帶(subventricular zone，SVZ)可終生持續產生NSCs。這些內源性NSCs 能夠自我更新，具有分化為神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞的潛能，它們為成體腦內的特定部位(海馬和嗅球)不斷提供新生細胞。NSCs 分化調控機制的研究對于其治療神經系統退行性疾病及功能修復具有重大意義［21－23］。

近年來的研究提示，主要有以下八個相關因素調控影響著內源性NSCs 增殖與分化:(1)神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、(2)內皮細胞生長因子(endothelium growth factor，EGF)、(3)bFGF、(4)干細胞因子(stem cell factor，SCF)、(5)促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)、(6)誘導性一氧化氮合酶(the inducible form of nitric oxide synthase，iNOS)、(7)Wnt 蛋白、(8)凋亡前因子Bax。他們在不同的神經組織受損情況下，具有刺激內源性NSCs 增殖，營養和保護神經作用。其中有研究證實，將bFGF 注入側腦室能夠促進神經前體細胞的增殖，且這些增殖的神經前體細胞有50%以上表達NeuN，能夠存活6個月之久。更有研究指出bFGF 可以在神經組織受損后促進新生的NSCs 整合進入海馬區局部神經環路。在受損神經組織的發生發展中，用微管相關蛋白Ⅱ(Microtubule associated protein Ⅱ，MAP2)和突觸蛋白Ⅰ(Synaptic proteins Ⅰ)對海馬的CA1 區進行染色，發現經過bFGF 處理后樹突和突觸的數量明顯增多，其突觸形成通過電子顯微鏡觀察而得到了證實。進而通過逆行示蹤劑注射到海馬回下腳標記CA1 區的BrdU 陽性細胞，可發現新生的神經元在bFGF作用下整合進入了海馬組織的適當部位［24］。

當前PTSD 臨床治療仍然不夠理想，其中通過神經生物分子機制探究PTSD 發生發展機制也是現今的一大難點。但是前人通過實踐總結出來的研究顯示，通過內源性NSCs 的增殖、分化修復受損神經組織，減少神經元的凋亡在PTSD 發生機制、臨床治療、以及藥物應用等方面能提供廣闊的應用前景。通過bFGF 作為誘導基因，上調ERK，刺激經典Ras/Raf-1 磷酸化級聯放大反應，增強胞外進入胞內信號轉導通路及信號表達，從而促進NSCs 增殖分化，即這一過程的具體途徑可能為:bFGF→受體→小G 蛋白→啟動MAPK 途徑→MAPK (ERK1/2)→轉錄因子→生物效應［25－26］。若將其應用于PTSD 樣模型大鼠海馬組織具有可行性和深入研究的意義。

［1］Hong BZ，Park SA，Kim HN，et al.Basic fibroblast growth factor increases intracellular magnesium concentration through the specific signaling pathways ［J］.Mol Cells，2009，28 (1):13－7.

［2］Rabie AB，Lu M.Basic fibroblast growth factor up-regulates the expression of vascular endothelial growth factor during healing of allogeneic bone graft ［J］.Arch Oral Biol，2004，49 (12):1025－33.

［3］Choi JS，Kim HY，Cha JH，et al.Ischemic preconditioning induced activation of ERK1/2 in the rat hippocampus ［J］.Neurosci Letts，2006，409 (3):187－191.

［4］Piao CS，Kim JB，Han PL，et al.Administration of the p38 MAPK inhibitor SB203580affords brain protection with a wide therapeuticwindow against focal is Chemic insult ［J］.J Neurosci Res，2003，73 (4):537－540.

［5］Xie HF，Xu RX，Wei JP，et al.P-JAK2 and P-STAT3 protein expression and cell apoptosis following focal cerebral ischemiareperfusion injury in rats ［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2007，27 (2):208－211，218.

［6］Schrader LA，Bimbaum SG，Nadin BM，et al.ERK/MAPK regulates the Kv4.2 potassium channel by direct phosphorylation of the pore-forming subunit ［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2006，290 (3):852－855.

［7］Sun D，Bullock MR，McGinn MJ，et al.Basic fibroblast growth factor-enhanced neurogenesis contributes to cognitive recovery in rats following traumatic brain injury ［J］.Exp Neurol，2009，216(1):56－65.

［8］程祖玨，王 琳，王衛東，等.堿性成纖維細胞生長因子對體外培養成年大鼠海馬神經前體細胞ERK1/2 活性的影響［J］.江西醫學院學報，2004，44 (3):33－36

［9］Albertin G，Sorato E，Oselladore B，et al.Involvement of vascular endothelial growth factor signaling in CLR/RAMP1 and CLR/RAMP2-mediated pro-angiogenic effect of intermedin on human vascular endothelial cells ［J］.Int J Mol Med，2010，26 (2):289－294.

［10］Smith RS Jr，Gao L，Bledsoe G，et al.Intermedin is a new angiogenic growth factor ［J］.AM J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297 (3):H1040－47.

［11］Fortuna LR，Porche MV，Alegría M.A qualitative study of clinicians＇use of the cultural formulation model in assessing posttraumatic stress disorder ［J］.Transcult Psychiatry，2009，46(3):429－450.

［12］王慶松，張建華，張汝.大鼠海馬驚厥閾下電刺激PTSD 模型的建立［J］.解放軍醫學雜志，2001，26 (5):388-390

［13］Jillian FI，Mark CC，Malcolm RS，et al.Comorbidity of PTSD and depression in Korean War veterans:prevalence，predictors，and impairment ［J］.J Affect Disord，2010，125 (1-3):279－286.

［14］張婭玲，白艷秋，彭正午，等.創傷后應激障礙 (PTSD)的生物學研究概述［J］.現代生物醫學進展，2011，11(1):172－175

［15］劉媛，王正國，伍亞民.創傷后應激障礙的中樞神經系統機制［J］.中國臨床神經科學，2008，16 (4):442－446.

［16］王海濤.PTSD 大鼠海馬和下丘腦5-HT1A 受體活性及前額皮質ERK 變化的實驗研究［D］.中國醫科大學博士學位論文，2010.

［17］Watts SW.Activation of themitogen-activated protein kinase pathway via the 5-HT2A receptor ［J］.AnnNAcad Sci，1998，15(861):162－168.

［18］Callen PJ，Lockyer PJ.Intergration of calcium and Ras signaling［J］.Nat Rev Cell Biol，2002，3 (5):339－348.

［19］Crespo P，Xu NZ，Smionds WF，et al.Ras-dependent activation of MAP kinase pathway mediated by G protein β γ subunits［J］.Nature，1994，369 (6479):418－420.

［20］Lopez-Ilasaca M.Signaling from G-protein-coupledreceptors to mitogen-activated protein MAP kinase cascades ［J］.Biochem Pharmacol，1998，56 (3):269－277.

［21］Chuang TT.Neurogenesis in mousemodels of Alzheimer's disease ［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802 (10):872－880.

［22］Akerud P，Canals JM，Snyder EY，et al.Neuroprotection through delivery of glial cell line derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson＇s disease ［J］.J Neurosci，2001，21 (20):8108－8118.

［23］Conti L，Reitano E，Cattaneo E.Neural stem cell systems:diversities and properties after transplantation in animal models of diseases ［J］.Brain Pathol，2006，16 (2):143－154.

［24］Nakatomi H，Kuriu T，Okabe S，et al.Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors ［J］.Cell，2002，110(4):429－441.

［25］王衛東，江文，王洪典，等.堿性成纖維細胞生長因子與腦神經元再生［J］.卒中與神經疾病雜志，2002，9 (6):383－384.

［26］Tang K，Wu H，Mahata SK，et al.A crucial role for the mitogen-activated protein kinase pathway in nicotinic cholinergic signaling to secretory protein transcription in pheochromocytoma cells［J］.Mol Pharmacol，1998，54 (1):59－69.