扶正化瘀方對非酒精性肝纖維化小鼠肝組織血管生成基因的調(diào)節(jié)作用及其對肝纖維化的影響*

譚普芳，南月敏，王榮琦，趙素賢，杜靜華，牛學敏

扶正化瘀方對非酒精性肝纖維化小鼠肝組織血管生成基因的調(diào)節(jié)作用及其對肝纖維化的影響*

譚普芳，南月敏，王榮琦，趙素賢，杜靜華，牛學敏

作者單位：050051石家莊市河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科

第一作者：譚普芳，女，26歲，碩士研究生。主要從事慢性肝病的診治研究。E-mail：tanpufang@hotmail.com

【摘要】目的探討血管生成基因在非酒精性脂肪性肝纖維化形成中的作用，以闡明扶正化瘀方治療非酒精性脂肪性肝纖維化的作用機制。方法選用7~8w齡健康雄性C57BL/6J小鼠，給予高脂、蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食喂養(yǎng)8w，建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型。采用扶正化瘀方進行干預(yù)，以蛋氨酸-膽堿充足飲食設(shè)立對照組。以HE和Masson染色觀察小鼠肝組織脂肪變、炎癥和纖維化程度；采用RT-PCR、免疫組化和Western blot法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）及其下游因子血管內(nèi)皮生成因子（VEGF)和誘導型一氧化氮合酶（iNOs）mRNA及其蛋白水平。結(jié)果模型組小鼠肝細胞出現(xiàn)大泡性為主的脂肪變性，小葉內(nèi)可見點灶狀肝細胞壞死及炎細胞浸潤、竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成；應(yīng)用扶正化瘀方干預(yù)組動物肝損傷、炎癥及纖維化程度顯著改善，肝組織α-SMA、HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平亦較模型組顯著減低，依次為（3.83±0.53）對（8.33±2.32）、（3.02±0.55）對（4.50±0.78）、（3.23±0.94）對（7.40±1.54）和（3.60±0.96）對（9.94±1.60），（P<0.01）；上述蛋白表達水平與基因水平呈一致變化趨勢，扶正化瘀方干預(yù)組與模型組α-SMA、HIF-1α、VEGF和iNOs表達水平依次為（0.53±0.04）對（1.08±0.20）、（0.44±0.02）對（0.55±0.08）、（0.54±0.07）對（1.08±0.03）、和（1.61±0.21）對（3.30±0.88），（P<0.05）。結(jié)論扶正化瘀方可通過抑制肝星狀細胞活化，下調(diào)HIF-1α及其下游促血管生成因子VEGF和iNOs表達，阻止或減緩非酒精性脂肪性肝纖維化的進展。

【關(guān)鍵詞】肝纖維化；非酒精性脂肪性肝纖維化；扶正化瘀；缺氧誘導因子-1α；小鼠

我們的前期研究表明，扶正化瘀方（Fuzheng Huayu recipe，F(xiàn)ZHY）可調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)炎癥和與纖維化相關(guān)的基因表達，阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的進展[1~3]。我們以高脂、蛋氨酸-膽堿缺乏（Methionine-choline deficient，MCD）飲食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型，應(yīng)用扶正化瘀方進行治療研究，為非酒精性脂肪性肝纖維化的中西醫(yī)結(jié)合診治提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1實驗動物及試劑清潔級7~8w齡健康雄性C57BL/6J小鼠18只，體質(zhì)量18~22g，購于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。蛋氨酸-膽堿充足及MCD飼料均購于美國ICN生物醫(yī)學化學藥品公司；扶正化瘀方參照上海黃海制藥有限責任公司扶正化瘀膠囊組方制備。鼠抗鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和兔抗鼠β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生成因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）多克隆抗體購于美國Proteintech公司，兔抗鼠誘導型一氧化氮合成酶（Inducible NO synthase，iNOs）多克隆抗體購于美國Novus Biologicals公司，山羊抗兔/鼠多克隆二抗購于美國Proteintech公司。

1.2非酒精性脂肪性肝纖維化模型的制備將18只小鼠隨機分為3組，每組6只。對照組（Control）：給予蛋氨酸-膽堿充足飼料喂養(yǎng)；模型組（MCD）：給予MCD飼料喂養(yǎng)；扶正化瘀方組（MCD+FZHY）：給予MCD飼料加扶正化瘀方15g·kg-1·d-1喂養(yǎng)。喂養(yǎng)8w后，各組小鼠禁食12h。在深度麻醉下，剖腹取肝臟，切取組織兩塊，浸泡于4%甲醛溶液，備行病理切片檢查，其余肝組織用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，備提取蛋白及RNA。

1.3肝組織病理學檢查參照2010年修訂的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[4]及美國非酒精性脂肪性肝炎（NASH）臨床研究協(xié)會病理工作組制定的NAFLD組織學評分（NAFLD activity score，NAS）系統(tǒng)[5]對肝組織病理改變進行評分。

1.4肝組織α-SMA、HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平檢測采用實時定量RT-PCR法，以Trizol法提取RNA，應(yīng)用Rever Aid First cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以適量cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參照，進行實時定量擴增。每個基因重復操作3次，運用2-△△CT法分析結(jié)果。依據(jù)Genbank設(shè)計引物序列，由上海生物工程公司合成，見表1。

1.5肝組織α-SMA蛋白表達檢測采用免疫組織化學法，隨機選取每張切片10個（200×）視野測定α-SMA表達面積百分比。

1.6肝組織HIF-1α、VEGF和iNOs蛋白表達檢測采用Western blot法，應(yīng)用Quantity one分析系統(tǒng)軟件分析電泳條帶灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.7統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1肝組織病理學表現(xiàn)模型組肝細胞呈大泡性為主的大、小泡混合性脂肪變，小葉內(nèi)可見點、灶狀肝細胞壞死及炎性細胞浸潤，竇周和匯管區(qū)纖維組織增生，纖維間隔形成（NAS評分為5~6分，肝纖維化評分為2~3期）；扶正化瘀方處理組動物肝細胞脂肪變、炎性改變和肝纖維化程度均較模型組明顯減輕（NAS評分為2~4分，肝纖維化評分為1~2期（圖1）。

2.2肝組織α-SMA變化實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比，模型組小鼠肝組織α-SMA mRNA水平顯著上調(diào)（P<0.001），扶正化瘀方處理組肝組織α-SMA mRNA水平明顯降低（P<0.001，圖2A）；免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，對照組肝組織α-SMA少量表達于匯管區(qū)小葉間動脈、小葉間靜脈和中央靜脈血管壁及膽管壁平滑肌，模型組及扶正化瘀方干預(yù)組除上述分布外，主要分布在纖維間隔及肝竇內(nèi)活化的星狀細胞（HSC）胞質(zhì)中，模型組α-SMA表達量較對照組顯著增加（P<0.001），經(jīng)扶正化瘀方干預(yù)后，表達量則明顯降低（P<0.001，圖2B）。

2.3肝組織HIF-1α、VEGF和iNOs的變化與對照組比，模型組小鼠肝組織HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA和蛋白表達均顯著上調(diào)（P<0.001），應(yīng)用扶正化瘀方后HIF-1α、VEGF和iNOs表達較模型組明顯降低（P<0.01，圖3）。C1分別為HIF-1α、VEGF、iNOs mRNA水平變化，MCD組小鼠肝組織HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平較對照組均顯著上調(diào)，應(yīng)用扶正化瘀方后HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平明顯降低；A2、B2、C2分別為HIF-1α、VEGF、iNOs蛋白表達變化，MCD組小鼠肝組織HIF-1α、VEGF和iNOs蛋白表達較對照組均顯著上調(diào)，應(yīng)用扶正化瘀方小鼠HIF-1α、VEGF和iNOs蛋白表達明顯降低。

與對照組比，*P<0.001；與MCD組比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

A1、B1、

3　討論

HIF-1是缺氧調(diào)控信息通路中的關(guān)鍵因子，主要由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，其中HIF-1α是主要調(diào)節(jié)亞基[6，7]。肝組織缺氧誘導HIF-1α表達增加，促進其下游靶基因VEGF和iNOs表達。VEGF是目前已知作用最強的促血管生成因子[8]，而血管生成與肝纖維化形成密切相關(guān)[9]。iNOs是一氧化氮合成過程中的關(guān)鍵限速酶，在缺氧等病理狀態(tài)下表達異常升高。本研究顯示，伴隨MCD飲食誘導的小鼠肝組織彌漫性脂肪變、炎細胞浸潤及纖維組織增生，肝組織α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs mRNA及蛋白表達顯著上調(diào)，其可能的機制為：①MCD飲食導致肝細胞脂肪變、小葉內(nèi)壞死性炎癥，誘導TGF-β1等炎性細胞因子釋放，使HSC活化并表達α-SMA，活化的HSC收縮性增強，使血竇收縮，并促進竇周間隙膠原沉積，引起肝竇內(nèi)皮細胞去窗孔化及基底膜形成，導致肝竇毛細血管化，肝臟微循環(huán)障礙，減弱了肝細胞和血液之間的氧和營養(yǎng)物質(zhì)交換，使肝組織出現(xiàn)缺氧狀態(tài)[2]；②缺氧誘導肝組織HIF-1α表達增加，其與下游靶基因VEGF和iNOs缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，促進上述因子表達，進一步加速HSC活化及Ⅰ型膠原分泌，導致肝纖維化[10,11]；③VEGF誘導血管生成，進而促進再生肝細胞團周圍形成血管叢和分流，肝內(nèi)血管結(jié)構(gòu)紊亂，使血竇和肝細胞物質(zhì)交換障礙，進一步加重肝組織缺氧，VEGF也可促進單核細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，向肝組織浸潤[12,13]，并可通過刺激HSC活化、增殖和遷移，增加Ⅰ型膠原表達，促進肝纖維化形成[14]；④iNOs可通過產(chǎn)生具有細胞毒性的NO，引起肝組織損傷及炎癥反應(yīng)，并可誘導VEGF合成，促進血管形成和血管滲透性增加，加速非酒精性脂肪性肝纖維化進展[15,16]。

扶正化瘀方由蟲草菌絲、桃仁、丹參、絞股藍、五味子、松花粉組成。既往研究發(fā)現(xiàn)，蟲草菌絲可以抑制二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠肝星狀細胞活化，增加肝竇血管內(nèi)皮細胞通透性，改善肝組織缺血缺氧狀態(tài)[17]；桃仁具有改善血吸蟲病肝纖維化肝竇毛細血管化，增加肝臟血流量，促進細胞外基質(zhì)降解[18,19]；丹參能下調(diào)四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達，顯著抑制HSC活化，明顯改善肝纖維化的程度[20]。本研究顯示，應(yīng)用扶正化瘀方小鼠伴隨α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs mRNA和蛋白表達的抑制，肝組織脂肪變、炎癥及纖維化程度明顯減輕，提示扶正化瘀方可能通過阻止HSC的活化及增殖，抑制肝竇毛細血管化，改善肝臟微循環(huán)及肝組織缺氧狀態(tài)，進而抑制HIF-1α及其下游基因表達；亦可能通過抑制Kupffer細胞及HSC表達VEGF，阻止新生血管形成，促進肝竇毛細血管化的逆轉(zhuǎn)，或可通過抑制iNOs表達，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)及肝細胞損傷，從而阻止肝臟炎癥及肝纖維化的發(fā)生和進展。此外，TGF-β1是誘導HSC活化的主要細胞因子[21]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方可下調(diào)肝臟TGF-β1表達[1]，提示該方可抑制TGF-β1激活HSC的作用，使HIF-1α及其下游血管生成基因表達減少，進而阻止肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

我們的研究結(jié)果表明，血管生成基因參與MCD飲食誘導的非酒精性脂肪性肝纖維化的形成，扶正化瘀方可通過抑制HSC活化，改善肝臟微循環(huán)，下調(diào)HIF-1α及其下游因子VEGF和iNOs表達，阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生和進展，為傳統(tǒng)中藥扶正化瘀方在臨床用于非酒精性脂肪性肝纖維化的治療提供了理論依據(jù)。

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（收稿：2015-03-07）

（本文編輯：陳從新）

·病毒性肝炎·

Impact of Fuzheng Huayu recipe on the expression of angiogenic growth factor in mice with nonalco-

holic fatty liver diseases

Tan Pufang，Nan Yuemin，Wang Rongqi，et al. Division of Liver Diseases，Department of

Integrated Traditional and Western Medicine，Third Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，Hebei Province，China

【Abstract】Objective To investigate the role of the angiogenic gene in the development of nonalcoholic fatty liver diseases（NAFLD）and to elucidate the mechanism of Fuzheng Huayu（FZHY）recipe in alleviating NAFLD related fibrosis in vivo. Methods Healthy male C57BL/6J mice aged 7~8 weeks were adopted to induce NAFLD related fibrosis by feeding methionine-choline deficient（MCD）diet for 8 weeks. Meanwhile，the intervention group was administrated with FZHY. Histological hepatic change in mice such as hepatic steatosis，inflammation and fibrosis were observed by hematoxylin & eosin and Masson trichrome staining. The expression of α-smooth muscle actin（α-SMA），hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）and its downstream factors e.g. vascular endothelial growth factor（VEGF）and inducible nitrogen synthase（iNOs）were detected by either quantitative real-time PCR or Western blot or immunohistochemistry. Results The mice in model group were present with macrovesicular steatosis，inflammatory infiltration and spotty and focal necrosis in hepatic lobule，peri-sinusoid fibrosis，and proliferation of fibrous tissues and fibrous septums in portal area，while the hepatic damage，inflammation and fibrosis in the intervention group were ameliorated by FZHY administration；Meanwhile，significantly down-regulated mRNA levels of α-SMA，HIF-1α，VEGF and iNOs in the intervention group were observed [（3.83± 0.53）vs.（8.33±2.32），（3.02±0.55）vs.（4.50±0.78），（3.23±0.94）vs.（7.40±1.54），（3.60±0.96）vs.（9.94±1.60），respectively，（P<0.01）for all]，and the protein expression were consistent with their mRNA，e.g. [（0.53± 0.04）vs.（1.08±0.20），（0.44±0.02）vs.（0.55±0.08），（0.54±0.07）vs.（1.08±0.03），（1.61±0.21）vs.（3.30± 0.88），respectively，P <0.05]. Conclusion FZHY recipe down-regulates the expression of HIF-1α and its downstream pro-angiogenic growth factors，VEGF and iNOs，by inhibiting the activation of hepatic stel－book=353,ebook=250late cells（HSCs），thus preventing or retarding the development of NAFLD related fibrosis in mice.

【Key words】Hepatic fibrosis；Nonalcoholic fatty liver diseases；Traditional Chinese hebal medicine；Hypoxiainducible factor-1α；Mice

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.005

通訊作者：南月敏，E-mail：nanyuemin@163.com

*基金項目：河北省自然科學基金資助項目（編號：H2013206276）；河北省中醫(yī)藥管理局科研基金項目（編號：2013015）；百洋肝纖維化研究基金（編號：001）