Nedd4L與肝纖維化發生關系的研究進展*

陳邦濤綜述，趙中夫審校

Nedd4L與肝纖維化發生關系的研究進展*

陳邦濤綜述，趙中夫審校

作者單位：046000山西省長治市山西醫科大學長治醫學院肝病研究所

第一作者：陳邦濤，男，26歲，碩士研究生。主要從事肝病的基礎與臨床研究。E-mail:1006626544@qq.com

【摘要】神經前體細胞表達發育調控樣基因（Nedd4L）所編碼蛋白屬于泛素連接酶E3，其對胞內蛋白的泛素化和降解過程至關重要，涉及到Nedd4L的作用方式以及活化與調節。越來越多的研究提示Nedd4L與癌癥、肥胖、高血壓以及纖維化發生過程息息相關，但其具體機制不甚明確。本文將討論Nedd4L的研究現狀，并重點介紹Nedd4L與肝纖維化發生的關系研究進展。

【關鍵詞】肝纖維化；神經前體細胞表達發育調控樣基因；發生機制

神經前體細胞表達發育調控樣基因（Neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like，Nedd4L）mRNA在肝、腎、肺、心臟組織中呈高水平。眾多研究發現Nedd4L與人類多種疾病的發生發展及治療轉歸息息相關。本文將對Nedd4L的作用方式、Nedd4L活化與調節、與人類疾病的關聯、以及NEDD4L基因敲除的動物實驗研究現狀進行總結，并重點闡述其與肝纖維化發生的關系。

1　Nedd4　L的基因位點及作用方式的研究

Nedd4L位于人類染色體18q2l.31，其包含38個外顯子，因而有多樣化的Nedd4L—mRNA，在NCBI數據庫中，至少有17種人類Nedd4L基因的異構體，但所有Nedd4L蛋白質均具相同的結構域（C2域+4個WW域+HECT域）[1]。Nedd4L可作用于上皮鈉通道（Epithelial sodium channel，ENaC）、Na-Cl共轉運體（NCC）、電壓門控鈉通道（Voltage-gated sodium channels，NAV）、鉀離子通道（KCNQ）等。（1）ENaC是一個由三個亞基（α，β和γ）且具有兩個跨膜區的異三聚體，功能正常的ENaC對維持體內鈉平衡、維持血壓、肺泡液的清除及氣體的交換至關重要[2]。在體實驗表明，Nedd4L的WW結構域可直接結合到ENaC三個亞基羧基末端的PY基序使ENaC泛素化而下調ENaC的表達[3]。（2）研究發現在SD大鼠腎小管細胞或培養中的mDCT細胞中缺失Nedd4L時可使NCC活性增加，有研究提示Nedd4L可與非洲爪蟾卵母細胞和轉染細胞表面的NCC相互作用并使其泛素化從而使NCC表達減少、活性降低，但尚不清楚這兩種蛋白質的相互作用方式，因為NCC無典型PY基序[4]。（3）NAV家族中有7個NAVs含有PY基序，可以與Nedd4L的3WW或4WW結構域相結合，在人胚腎細胞（Human Embryonic Kidney，HEK）中心臟NAv1.5可被Nedd4L的共表達抑制，有報道稱Nedd4L可下調成年脊髓背根神經節神經元細胞表面的NAV，最新研究發現在神經性疼痛的動物模型中，Nedd4L下調或缺失將導致DRG神經元興奮性增高[5，6]。（4）Nedd4L的共表達可影響心臟鉀離子通道（KCNQ）α亞單位與KCNEβ亞單位組成的KCNQ/KCNE通道復合物，在體荷蘭豬心肌細胞中催化滅活Nedd4L活性可增加KCNQ1電流，進一步研究發現在HEK239細胞中由于Nedd4L共表達的泛素化作用使KCNQ1水平降低，這種泛素化作用在非洲爪蟾卵母細胞和導管上皮細胞中已被證實[7，8]。最新體外實驗研究發現，通過干擾與HERG（Human ether a go go related gene）鉀通道相結合的Nedd4L結構域可完全消除毒蕈堿受體對HERG鉀通道蛋白表達的影響，其Nedd4L是通過泛素化降解hERG鉀通道[9]。（5）Nedd4L還可通過其WW結構域使胞膜RNA病毒（如HIV-1）的基質蛋白泛素化而降解或變異[10]。其它尚處于爭議的作用物有氯通道、肺泡表面活性物質、EAAT1/2、巴胺轉運體等。

2　Nedd4　L活化與調節

（1）.通過其WW域與HECT域的LPxY基序微弱結合的這種分子內交互作用可抑制其自身泛素化，LPxY基序突變可降低Nedd4L結合ENaC亞基并抑制ENaC的活性[11]。（2）.去泛素化的泛素特異性蛋白酶2-45（Deubiquitinase ubiquitin-specific protease DUB Usp2-45）：Usp2-45的催化域和N末端與Nedd4L的HECT域相互作用可降低非洲爪蟾卵母細胞ENaC的泛素化并增加其在細胞表面的表達[12]。（3）. Nedd4家族交互作用蛋白（NEDD4 family-interacting protein，NDFIP）適配器：現已在高爾基復合體、內涵體和多囊脂質體內發現NDFIP1、NDFIP2兩種具有3個跨膜區和3個PY基序的適配器，通過NDFIP1，WWP2連接區和Nedd4L相互作用可調節二價金屬離子轉運體，而在神經元中高表達NDFIP1可促進Nedd4、Nedd4L、ITCH蛋白進入內涵體，最近發現NDFIP1/NDFIP2與水通道蛋白2（Water channel aquaporin 2，AQP2）的相互作用對Nedd4/Nedd4L泛素化AQP2并使其降解至關重要[13，14]。（4）. 14-3-3蛋白：14-3-3蛋白是一種廣泛表達的結合在磷酸絲/蘇氨酸基序的接頭蛋白，研究顯示14-3-3蛋白可與Nedd4L的磷酸絲氨酸結合而阻止目標蛋白間的相互作用，當蛋白激酶如血清和糖皮質激素誘導蛋白激酶（Serum and glucocorticoid inducible protein kinase1，SGK1）和AKT磷酸化Nedd4L特定的絲氨酸殘基后可促使14-3-3蛋白的結合，從而抑制Nedd4L的功能，SGK1不僅可磷酸化Nedd4L且本身也是Nedd4L的作用底物[15]。SGK是一種廣泛存在于各種組織和細胞中的快速誘導的絲／蘇氨酸蛋白激酶，它能夠通過磷酸化影響目的蛋白的活性、穩定性、細胞內分布，而參與調節多條信號通路及細胞增殖、凋亡等多種細胞應答.

3　Nedd4　L與人類疾病的關聯研究

既往研究證實Nedd4L與非小細胞肺癌、胃癌、預后較差的神經膠質瘤、結直腸癌、膀胱癌、Sezary綜合征關系密切，最新研究發現，Nedd4L基因沉默可減緩培養中的黑色素瘤細胞生長，而Nedd4L過度表達可促進異體移植模型黑色素瘤細胞生長[16]，在胰腺導管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）中，Nedd4L通過miR21，miR23a and miR27a而減輕PDAC細胞的增殖[17]，在由Wnt/β-catenin信號引起的人肝細胞癌中，Nedd4L呈高水平表達[18]。rs4149601（G/A）基因移碼突變造成編碼蛋白截短，是Nedd4L基因的隱匿性剪切位點，功能研究表明此基因變異通過上皮鈉通道通路（ENaC-Nedd4L-SGK1）可引起鈉離子重吸收增加，從而在調節機體血壓方面起重要作用，最新研究證實rs414960l A等位基因是高血壓的危險因素（OR值：1.31，95%CI:1.11-1.55），體位性低血壓的保護因素（OR=0.68，95%CI:0.48-0.98），并對氫氯噻嗪的降壓效果更敏感（P<0.05）[19]。但一項對新疆哈薩克族人群的研究顯示，rs414960l多態性與該人群中心性肥胖相關而與該人群高血壓病不相關，D-C-G-C（296921-3delTTG/ rs2288774/rs2288775/rs4149601）單體型可能是該種族人高血壓病的易感因素；rs3865418多態性與該人群中心性肥胖不相關，GG基因型可能是哈薩克族人群中心性肥胖的易感因素[20~22]。

4　Nedd4　L基因敲除的動物實驗研究

在Shi et al[23]在大鼠研究中發現，Nedd4L基因敲除的大鼠可正常生長發育且具有正常壽命，但卻表現出ENaC表達輕度增加以及輕微的鹽敏性高血壓，這表明Nedd4L對ENaC的調控至關重要并進一步證實了相關體外研究結果。而與Shi等人研究結果相反的實驗[24]顯示在C57B16純遺傳背景下，Nedd4L基因敲除大鼠模型顯示出胎兒期或圍產期致死性，同時在這些大鼠中也未檢測到Nedd4L-mRNA和蛋白質，并且大多數大鼠由于肺泡塌陷以及在肺和腎臟中高表達ENaC而在出生前死亡，與ENaC高表達一致，在II型肺泡上皮細胞中也檢測到ENaC電流增加，這極有可能是導致未成熟肺液清除障礙、肺泡充氣受阻的原因；而雖有極少部分大鼠活到了22天，但也因在肺和腎臟中高表達ENaC以及嚴重的肺炎而死亡；Kimura et al[25]報道在大鼠肺上皮細胞中耗竭Nedd4L基因會導致一種以氣道粘液排除受阻和嚴重炎癥為特征的囊性纖維性樣病變，顯得尤其重要的是，在其研究中給予阿米洛利（ENaC抑制劑）可以挽救新生個體肺泡細胞的表型。在另一項[26]特異性誘導大鼠腎小管Nedd4L基因耗竭的實驗中發現，當給予高鈉飲食會顯示出可被氫氯噻嗪（NCC抑制劑）糾正的高鈣尿癥和高血壓，且伴隨著NCC蛋白水平增加、β及γENaC和腎髓質K+通道的表達增加；特異敲除大鼠神經元細胞Nedd4L基因實驗和在非洲爪蟾Nedd4L基因消融實驗中[27～29]發現Nedd4L基因對于軸突的生長至關重要，其缺乏將導致軸突復雜性降低，然而Nedd4L基因是否通過泛素化途徑調節軸突復雜性抑或通過Nedd4L基因的作用底物影響軸突尚不甚明確。最近一項在驗證敲除Nedd4L基因的大鼠神經元細胞膜Nav.通道是否有畸變的實驗中意外發現，在脊髓被根神經節和皮質神經元的Nav.通道表達如常，提示其不受Nedd4L基因調控。然而，Nedd4L基因隨著細胞內Na+濃度增加而激活并且下調皮質神經元的Nav.通道，提示其如ENaC一樣，Nav.通道蛋白也受Nedd4L蛋白泛素化作用、胞吞作用以及隨后的細胞內降解作用而反饋抑制調節[30]。

5　Nedd4　L與肝纖維化的關系研究

在我國，各種末期肝病如肝硬化及肝癌已成為嚴重危害人類生命健康的醫學問題。肝纖維化是慢性肝臟疾病進展至肝硬化甚至肝衰竭、肝癌的共同病理過程，近年來的大量臨床和實驗研究表明，肝纖維化是可逆性病理過程[31]。肝纖維化的基本病理特征為細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）合成增多和降解相對不足，而在肝內大量堆積[32，33]，而對其發生發展的機制及其防治的研究已成當今醫學界防治肝硬化的熱點。肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）仍然被認為是ECM的主要來源細胞[34]，由于HSC的激活是肝纖維化發生發展中的一個關鍵事件，所以研究HSC的激活對探索肝纖維化發生機理及抗肝纖維化的有效防治均有特別重要的臨床意義[35]。目前公認的最重要的促肝纖維化細胞因子當屬血小板源性生長因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）和轉化生長因子β（Transforming growth factorβ1，TGF-β1）[36]，其對HSC活化、增殖、轉化的調節起關鍵作用。另外，HSC轉化為肌纖維母細胞（Myofibroblast，MFB）后除可以產生大量以膠原為主的ECM成分外，又能通過自分泌和旁分泌方式產生TGF-β1等細胞因子維持肝纖維化的發展[37]。因此, TGF-β1對H S C的激活、轉化、分化及調節具有極其重要的作用。

已經發現調控肝纖維化的細胞內信號通路主要有:（1）. TGF-β-Smad信號通路。（2）. PDGF信號通路（Ras/ERK信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶PI-3K信號通路、JAK/STAT信號通路）。（3）. FAK、PI3K/Akt信號通路。（4）.核因子-κB （NF-κB）信號通路。（5）. TLR信號通路。（6）.整合素（Integrin）信號通路。（7）. Wnt信號通路。（8）. Hedgehog（Hh）信號通路。（9）. Rho-Rock信號通路。（10）.血管緊張素Ⅱ信號通路。（11）.氧化應激、ROS信號通路。既往大量研究已經證明TGF-β1/Smad信號通路仍是產生ECM最主要的信號通路[38，39]。基本的TGF-β1/Smad信號轉導系統為：首先由TGF-β結合到HSC表面TGFβ受體Ⅱ（TβRⅡ），再活化TβR I，然后再磷酸化而激活RSmad（Receptor -phosphorylated SMADs，RSmad）。RSmad蛋白包括Smad1、2、3、5、8，其中主要傳遞蛋白是Smad2和Smad3。p-Smad2、3與CoSmad （Common mediater Smads，Co-Smads）蛋白Smad4形成活性的轉錄復合物進入核內，與核協同或抑制因子結合，調節目的基因的轉錄。Smad6和Smad7可以負性調節這一傳導過程，被稱為ISmad（Inhibitory Smads，I-Smads）[40]。其中Smad3是主要促進HSC產生組織纖溶酶抑制物（PAI-1）及I型膠原蛋白（Collagen I）的蛋白。PAI-1可通過抑制纖溶酶和基質金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）的活性，進而抑制ECM的降解。有研究表明缺失Smad3的小鼠可以抵抗DMN、CCL4或TAA誘導的肝纖維化，說明Smad3是Smad信號通路中起決定作用的蛋白。近幾年研究發現泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteosome pathway，UPP）可通過泛素化降解Smads蛋白而調控TGF-β1/Smad信號通路。

UPP是目前己知的所有真核生物體內具有高度選擇性的最為重要的胞內蛋白降解的主要途徑，是由泛素、泛素連接酶（Ubiquitin activating enzyme）、26S蛋白酶體和泛素再循環酶組成。泛素連接酶包括泛素活化酶E1、E2、E3，其中泛素連接酶E3在識別靶蛋白及隨后的蛋白質降解中起關鍵作用[41]。現已發現鑒定的泛素連接酶E3主要有三大類: HECT結構域家族、RING結構域家族和U-box蛋白家族，其中主要的是HECT E3，它可以通過調節靶蛋白的泛素化，影響靶蛋白的活性、定位以及蛋白質結構的改變，而參與細胞的信號傳導、基因轉錄、細胞分裂和分化等許多過程的調節[42]。Zhang等2001年首先發現降解Smad1、2、7的E3泛素連接酶Smurf（Smad ubiquition regulatory factor），揭示Smads蛋白降解受UPP調控。

Nedd4L編碼蛋白也即E3泛素連接酶，屬UPP途徑的重要成分，Nedd4L調節TGF-β1的信號通路的研究不盡統一。Kuratomi et al[43]發現Nedd4L通過Smad7（含PY基序）下調TGF-β1受體并通過泛素化使該受體降解，且Nedd4L 在HepG2細胞過度表達可使TGF-β信號肽的表達降低，而沉默Nedd4L可增加TGF-β信號肽的表達，進一步研究發現Nedd4L是通過泛素化降解Smad2調節該過程。最近Gao et al[44]發現在人胚腎細胞HEK293T中Nedd4L還可通過泛素化降解磷酸化Smad3，而限制TGF-β1的信號通路。用蛋白酶體抑制劑MG132或RNAi技術抑制Nedd4L活性或減少其表達，均能增加TGF-β1誘導的磷酸化Smad2/3和PAI-1的表達。有文獻報道Nedd4L與其他激酶不同，在靜息細胞中具有活性，可對靶蛋白維持泛素化狀態；而當其自身被磷酸化時，就失去酶活性，解除對靶蛋白的泛素化[45]。

有研究發現SGK可通過磷酸化而調控Nedd4L活性。比如Debonneville[46]發現在卵母細胞中SGK可以使Nedd4L發生磷酸化，而失去降解上皮Na離子通道ENaC的能力，增加ENaC。Flores[47]在體外用醛固醇刺激小鼠mpkCCDcl4細胞，發現醛固酮能增加p-Nedd4L、SGK表達及ENaC數量。在切除腎上腺的大鼠腎組織中同樣發現p-Nedd4L、SGK表達及ENaC數量增加。Dieter et al[48]將SGK質粒轉入卵母細胞發現SGK可以增加高糖誘導的p-Nedd4L和Na（+）高糖運載體SGLT1表達。Gao實驗發現由TGF-β1激活的Smad3的活性的50%可被Nedd4L抑制，并通過轉染HEK293T細胞SGK質粒，發現SGK可以磷酸化Nedd4L，阻止Nedd4L與Smad3結合，減少Smad3的泛素化。而且一些臨床和實驗室證據已表明，慢性病毒性肝炎肝硬化、肺纖維化、糖尿病腎病患者病變組織中SGK表達較正常人明顯增高[49，50]。Fillon[51]轉染HepG2細胞具有正常活性野生型SGK質粒和突變體SGK質粒，結果發現H2O2可以增加轉染野生型SGK的HepG2細胞纖維連接素（fibronectin，FN）表達,而不增加轉染突變體SGK的FN表達；Feng將SGK野生型和突變體轉染腎小球系膜細胞（HMC），同樣發現高糖可以增加轉染野生型SGK質粒的FN表達,而不能增加轉染突變體SGK質粒的FN表達。這些結果均提示Nedd4L和SGK可能參與肝纖維化的發生。

6　展望

本文主要總結了近些年Nedd4L在動物模型中的相關研究，其中研究最明確的是對ENaC的影響，而對其他如調節肝纖維化的TGF-β1的信號通路的作用方式不甚明確，且在動物模型中的相關研究甚少。在今后的研究工作中，若能明確Nedd4L對肝纖維化發生發展的作用機制，有望為以Nedd4L為靶點的肝纖維化的防治提出新的理論依據。

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（收稿：2015-04-28）

（本文編輯：張駿飛）

·綜述·

Fibrogenesis of neural precursor cell- expressed developmentally down- regulated gene 4- like gene in liver fibrosis

Chen Bangtao，Zhao Zhongfu. Institute of Liver Diseases，Changzhi Medical College，Shanxi Medical University，Changzhi 046000，Shanxi Province，China

【Abstract】Protein encoded by neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like（Nedd4L）gene belongs to the ubiquitin ligase E3. Tt is important for ubiquitination and degradation process of intracellular proteins，which involves in the action mode，activation and regulation of Nedd4L. More and more researches points out that cancers，obesity，hypertension and fibrosis are closely related to action of Nedd4L，but the specific mechanisms are far from clear. This review focuses on the fibrogenesis of Nedd4L in liver fibrosis.

【Key words】Liver fibrosis;Neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like gene；Fibrogenesis

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.030

通訊作者：趙中夫，E-mail:zhaozf_1226@163.com

*基金項目：長治醫學院科技創新團隊項目（編號：CX201404）